Introducción a la tecnología Cre-lox
El sistema Cre-lox es una herramienta sofisticada para nocauts generales, noqueos condicionales y cepas de reporteros.
El mecanismo Cre-lox se descubrió en el bacteriófago P1 como parte del ciclo vivo viral normal de este organismo (Sauer y Henderson 1988; Sternberg y Hamilton 1981). El bacteriófago utiliza la recombinación Cre-lox para circularizar y facilitar la replicación de su ADN genómico cuando se reproduce. Desde su descubrimiento, la estrategia de recombinación del bacteriófago se ha desarrollado como una tecnología para la manipulación del genoma y se ha aplicado con éxito en cultivos de células de mamíferos, levaduras, plantas, ratones y otros organismos (Araki et al. 1987). Gran parte del éxito de Cre-lox se debe a su simplicidad. Requiere solo dos componentes:
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- Cre recombinasa: una enzima que cataliza la recombinación entre dos sitios loxP
- Sitios LoxP: secuencias específicas de 34 pares de bases (pb) que consisten en una secuencia central de 8 pb, donde tiene lugar la recombinación, y dos repeticiones invertidas de 13 pb flanqueantes (Figura 1)
Los ratones TSC1 flox / flox tienen un par de sitios loxP que flanquean cada extremo del gen TCS1. Los sitios loxP son reconocidos por las enzimas Cre recombinasas activas, que cuando están presentes, se unirán a loxP y eliminarán el gen TCS1.
Los ratones CamKII-Cre expresarán Cre recombinasa solo en las neuronas piramidales de la corteza, ya que está bajo el control del promotor (alfa-) CamKII.
En la generación F0, cuando cruzas ratones TSC1 flox / flox con ratones CamKII-Cre, la progenie (generación F1) tendrá los genes floxed-TSC1 y CamKII-Cre. Una vez que comienza el desarrollo del prosencéfalo, las neuronas comenzarán a expresar Cre recombinasa a través de su promotor CamKII. Luego, la Cre recombinasa activa comenzará a funcionar y cortará la secuencia TSC1 entre los sitios LoxP, “eliminando” el gen. El resultado es un mouse inactivo condicional TSC1 (cKO). Aquí se llama “condicional” porque el gen se elimina solo de las neuronas que expresan CamKII. Un ratón KO normal tiene el gen eliminado de todas las células del cuerpo.
[Figura de Wikipedia: recombinación Cre-Lox]
Nota al margen: Un ratón flox / flox es homocigoto para este transgen. Sin embargo, un ratón TSC1 flox / + tiene un alelo transgénico y un tipo salvaje. Cruzar un ratón heterocigoto con un ratón CamKII-Cre producirá una generación F1 mixta: algunos con el alelo de tipo salvaje y algunos ratones cKO. En algunos casos, esto puede ser útil.
