En la genética de la mosca, ¿cuáles son las dificultades en el uso de proteínas fluorescentes (como GFP) como marcadores?

1. Colocación
1. A veces, el posicionamiento del fluoróforo en el extremo N o C (los extremos) de la proteína no funciona, por varias razones.
1. Puede localizar mal la proteína al ocultar una etiqueta de localización
2. Puede perturbar su capacidad de unirse a otras proteínas o ligandos asociados
3. Puede obstruir residuos importantes para una regulación adecuada (por ejemplo, modificaciones postraduccionales como la fosforilación (generalmente activada) o la ubiquitinación (para la degradación)
2. El posicionamiento interno de la etiqueta (no en los extremos) podría perturbar los elementos estructurales secundarios y / o terciarios necesarios para la estructura / función de la proteína.
1. Esto podría deberse a que no puede unirse a un ligando o una proteína asociada.
2. Esto puede deberse a que no permanece soluble y / o se agrega y precipita
2. Señal
1. Expresión heterocigota
1. Una sola copia genética podría ser insuficiente para que una señal lo suficientemente buena se pueda observar en la mosca (generalmente es más una trampa en la imagen en vivo. Con cualquier tipo de células fijas, puede usar anticuerpos que serían más sensibles)
2. Expresión homocigota
1. Puede ser necesario para una buena señal. Si aún no es lo suficientemente bueno, es posible que necesite que su proteína se exprese bajo un promotor que maneja para sobreexpresar (por ejemplo, UAS / GAL4). Esto puede causar otros problemas, que se abordan a continuación.
3. Fondo de autofluorescencia
1. Otras características / contenidos de las células serán fluorescentes cuando se exciten a 488 nm (GFP máx. Ej.) Y otras longitudes de onda. Los filtros de emisión pueden ayudar a excluir algunos, pero tendrá que distinguir cuál es su proteína etiquetada con GFP y cuál es el fondo. Esto es particularmente difícil en el ovocito de drosophila, donde los gránulos de yema autofluorescentes emiten mucha luz
3. Función perturbada
1. Función inhibida
1. Si la proteína funciona, pero no tan bien como la endógena (normal, de tipo salvaje), puede inhibir el desarrollo o el comportamiento del animal.
2. La expresión homocigota puede ser necesaria, y luego tendrá ambas copias de proteínas expresadas con efectos perjudiciales
2. Función aumentada / alterada
1. Si la colocación de GFP altera la forma en que se marca una proteína para su destrucción, se apaga o se regula de otra manera, puede volverse hiperactiva en una o múltiples vías, cambiando las poblaciones relativas de diferentes moléculas dentro de la célula. Esto podría alterar la homeostasis, la estructura celular y cualquier otra cosa con la que su proteína esté relacionada dentro de la célula.

Cada una de estas cosas consideradas, no se desanime si está interesado en etiquetar una proteína. Muchos son sorprendentemente susceptibles a la adición de un fluoróforo, y a menudo se puede unir simplemente a uno de los términos.