Hay tres generaciones principales de tecnología de secuenciación … Estamos funcionalmente en el segundo en este momento, ¡pero el tercero está llegando rápidamente!
Primera generación: secuenciación Sanger o secuenciación capilar: se utiliza para encontrar la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN amplificado específico . El ADN de interés se amplifica con cebadores y luego se fragmenta en diferentes longitudes. Estos fragmentos de diferente longitud de la misma secuencia de ADN tienen un nucleótido indicador único unido (ddNTP) + radiomarcador o fluoróforo en su extremo con una polimerasa (el ddNTP detiene la polimerasa después de la primera adición. Los fragmentos se pasan a través de una matriz de gel que se separa puede leer el reportero y así obtener el siguiente ATC o G en la secuencia. Esto se adaptó en capilares pequeños en lugar de geles para la separación, lo que permite un mayor rendimiento.
Segunda generación (primero llamada secuenciación de próxima generación): cada una de las empresas desarrolló sus propios métodos, pero la idea principal es tomar una muestra de muchos fragmentos de ADN diferentes y amplificarlos y secuenciarlos en forma de “escopeta” o “paralela” al mismo tiempo. . Los principales competidores son Illumina (Secuenciación por síntesis), Roche 454 (Pyrosequencing) y ABI Solid (Secuenciación por ligadura). Los métodos son dramáticamente diferentes a nivel molecular, y debo decir que es bastante interesante de aprender, pero más de lo que puedo ampliar en este espacio … La secuenciación de segunda generación es el estándar actual de la industria, con Illumina (Solexa) actualmente siendo el líder. La desventaja de todos estos métodos es que las longitudes de lectura son muy cortas, aproximadamente de 100 a 500 pares de bases como máximo, lo que hace que reunirlos en genes completos o genomas sea todo un enigma. Lo que salva estas tecnologías es el hecho de que generan cientos de miles a cientos de millones de lecturas, lo que permite que las secuencias cortas se alineen entre sí en regiones superpuestas. El número de secuencias que cubren la misma región se conoce como “cobertura”, y con la secuenciación del genoma humano, la cobertura 10X es el mínimo y 30X se considera un estándar de alta calidad. Esta cobertura es necesaria para superar posibles errores que suceden en la preparación de secuenciación, amplificación o debido a que la muestra es heterogénea. (Los humanos son diploides, lo que significa que una persona podría tener una A del genoma de la madre en una posición y una G del papá, 10X es el mínimo para saber si una persona es homocigótica AA o GG o heterocigota AG).
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Tercera generación: esta es la próxima ola, que es aquí en teoría, pero las altas tasas de error y las dificultades técnicas impiden el uso generalizado. ¡La diferencia clave es que estos hacen secuenciación de moléculas individuales! Lo que esto significa es que no necesita amplificar su ADN, en teoría, cada pieza de ADN que coloca en la máquina se secuencia individualmente. A continuación se muestra un diagrama de Oxford Nanopore. Cómo funciona esto es que tienes una placa con millones de pozos pequeños, y en el fondo de cada uno de estos pozos hay una ADN polimerasa, que toma un pedazo de ADN que cae en el pozo y lo atraviesa leyendo cada base a medida que avanza . Realmente no lo está leyendo, pero la nanoingeniería permite detectar si un ATC o G está atravesando el poro por pequeñas diferencias en la liberación eléctrica, lo que le da una secuencia cada vez que un fragmento de ADN atraviesa un pozo. Ion Torrent de Life Technologies es similar porque detecta cambios de pH causados por reacciones con una sola molécula de ADN. Estas tecnologías deberían permitir un mayor rendimiento, una mejor cobertura de todas las secuencias presentes sin posible sesgo de amplificación, y lo mejor de todo para nosotros los genetistas ¡SECUENCIAS MÁS LARGAS! Digo ‘debería’ porque, aunque bastante cercanas, estas tecnologías no se han perfeccionado lo suficiente como para suplantar aún el poder de las tecnologías de segunda generación. ¡Pregunte si algo de esto no está claro o si desea una explicación más detallada! -Andy B.
