Solo un tecnicismo:
Ni el crRNA ni el tracrRNA del sistema CRISPR / Cas9 Tipo II son adecuadamente mRNA. Realmente, son ncRNAs (RNA no codificantes).
Ahora el punto principal:
El ARN incorporado en la nucleasa Cas9 necesita tener 2 características clave:
- Cadena simple para que se hibrida con la secuencia objetivo
- Estructura secundaria para caber en el bolsillo de unión tracrRNA Cas9
Eche un vistazo a esta descripción aproximada del complejo sgRNA-Cas9 (que es bastante similar al complejo crRNA-tracrRNA-Cas9 natural). Como nota, las construcciones de sgRNA (a veces llamadas chiRNAs) se desarrollaron como quimeras de crRNA y tracrRNA (el crRNA es la secuencia de reconocimiento de objetivo, mientras que el tracrRNA contiene varios bucles de tallo).
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[1] Bassett, A y JL Liu (2014) Ingeniería genómica mediada por CRISPR / Cas9 en Drosophila . Métodos , 69 (2) : 128-136. doi: 10.1016 / j.ymeth.2014.02.019
Ingeniería genómica mediada por CRISPR / Cas9 en Drosophila
Esta reacción tiene lugar a temperaturas fisiológicas, por lo que claramente dsDNA no es una alternativa viable para la porción de crRNA, ya que necesitaría desnaturalizarse para hibridarse con la secuencia diana.
Y, por supuesto, las secuencias cortas de dsDNA no se pliegan particularmente bien, por lo que tampoco es una alternativa viable para la porción de tracrRNA.
