Dado que su expresión se realiza in vitro , es poco probable que la culpa sea la proteólisis, a menos que haya contaminado su muestra de alguna manera o haya una enzima preoteolítica presente en el lisado.
La forma de verificar esto es sumar los tamaños de tus dos bandas. Si se suman al tamaño de su producto deseado, entonces sí, está experimentando una preteólisis. Siga la respuesta recomendada de Jeannine Garnetts a esta pregunta y agregue nuevos inhibidores de la proteasa.
Sin embargo, si tiene una banda que es el tamaño de su producto deseado y una que es más corta, entonces está experimentando una traducción incompleta en algunas ocasiones que resulta en una proteína truncada.
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Si este último es el caso, entonces puede haber un lugar en el ARNm que al ribosoma no le “guste” y finalice prematuramente la traducción. Tal vez su ARNm a veces está formando estructuras secundarias que el ribosoma no puede leer (bucles de tallo, dímeros de ARNm, etc.), encontrando un codón raro o cambiando de marco a un marco donde está encontrando un codón de parada. Dado que en este caso está obteniendo su producto previsto algunas veces, es posible que no necesite solucionar el problema, sin embargo, si lo desea, le recomiendo algunos métodos para hacerlo a continuación.
Primero, descubra dónde ocurre el problema. Secuencia de la proteína truncada. Vea dónde la secuencia de aminoácidos diverge de la proteína deseada. Si la secuencia nunca diverge y simplemente termina, lo más probable es que se trate de una estructura secundaria de ARNm o un codón raro. Si los resultados de la secuenciación de aminoácidos muestran una divergencia, entonces se trata de un desplazamiento del marco ribosómico.
Caso 1: codón raro
Verifique si tiene un codón raro alrededor de la ubicación del truncamiento. Puede encontrar una base de datos de uso y frecuencia de codones en http://www.kazusa.or.jp/codon/. Cambia los codones raros cerca de la región de truncamiento. No debería necesitar modificar nada más que 3 o 4 codones en cualquier dirección.
Caso 2: formación de estructura secundaria de ARNm
Ingrese su secuencia de ARNm en un algoritmo de predicción de estructura secundaria como el descrito por Aalberts et. al en http://rna.williams.edu. Reemplace los codones que están causando una alta afinidad auto-vinculante con otros que disminuyen la magnitud de la energía libre delta Gibbs. ¡Asegúrese de no usar los que son especialmente raros! Cuando la predicción llegue a algo que no esté causando estructuras secundarias, reconstruya su plásmido y estará listo para comenzar.
Caso 3: cambio de marco ribosómico
A partir de la secuencia de aminoácidos, puede saber en qué punto del mensaje el ribosoma está cambiando de marco. Con frecuencia, esto se debe a “secuencias resbaladizas”, como CUU-AGG-C observada en el gen de levadura ABP140 y el sitio de desplazamiento del marco del retrotransposón Ty1 que puede promover alrededor del 40% de cambio de marco. Si tienes una secuencia similar a esta corriente arriba del desplazamiento de cuadros, entonces ese es tu culpable. Nuevamente, modifique su plásmido con codones no raros y debería estar listo.
-Robert
Asistente de investigación graduada
Departamento de Ingeniería Biomédica Conjunta NCSU / UNC
Laboratorio de Bioinformática del Departamento de Ciencias de la Computación de la NCSU
