En pocas palabras, el principio es el mismo: tiene dos cebadores (FW y RV). Están diseñados contra un objetivo específico o están diseñados para unirse contra varios objetivos pero tienen una secuencia conservada en común.
Ahora, en PCR en tiempo real, el uso de cebadores se combina con un tinte fluorescente que se une dentro de un ADN de doble cadena (también conocido como agente intercalante, como SYBR Green) o con sondas que llevan consigo un fluorocromo y un extintor. Tanto el enfoque (si necesita conocerlos en detalle que le explicaré, pero aquí me limitaré a la pregunta principal) permiten monitorear la amplificación de la molécula de ADN objetivo durante el paso de amplificación, en tiempo real, proporcionando al investigador Un análisis cuantitativo.
¿Por qué es útil esto?
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¿Qué hace la PCR? Se amplifica Cada evento de amplificación se llama ciclo de amplificación. Por lo general, los círculos de amplificación se mantienen por debajo de los 30 ciclos por reacción (entre 25 y 28). ¿Por qué esto? Porque la PCR se usa para ver si hay algo allí o no, o si hay algo más en esta condición en comparación con un control. Si los pasos de amplificación son demasiados, no podrás entender si algo está realmente allí o si estás viendo una señal solo porque dejas que se amplifique tantas veces, de modo que eventualmente parezca que hay algo allí (recuerda. no decir “cuantificar” porque la PCR estándar hace imposible por su naturaleza hacer eso).
Por ejemplo, A era menor que B. La amplificación comienza y después de 30 ciclos se ejecuta un gel y A y B tienen una señal fuerte. Entonces dices “A = B, no hay diferencia entre control y experimento”. Esto no hubiera sucedido si hubieras hecho solo 25 ciclos, por ejemplo, ¿Ves lo que quiero decir?
Si bien con PCR en tiempo real, puede ver ciclo por ciclo la cantidad de amplificador (la cadena amplificada) en ese momento durante ese ciclo específico. Entonces, si ejecuta 30 ciclos, cuando obtiene el resultado, al observar el ciclo de amplificación anterior, puede decir “ok, la diferencia es real” o “no hay diferencia”.
Esto es realmente de los trabajos de software. Tiene un umbral (por lo que verá la señal, solo si está por encima de una cierta cantidad, esto puede establecerlo el scitista, en función de su propia experiencia de necesidad). Y como puede ver, arriba de 30 ciclos, la cifra comienza a estabilizarse. En este momento no será posible distinguir entre las cosas, ¡porque se verán iguales! Pero, el software le permite mirar a través de todos los ciclos y tener una visión general de lo que sucedió ciclo por ciclo.
Espero que ayude, si necesita más detalles o alguna aclaración, solo hágamelo saber.
