¿Cuál es el procedimiento de ingeniería CRISPR / Cas9 para insertar una variante en LCL? La Ciencia y la Tecnología mejoran el futuro

Esta es una pregunta difícil. Estás pidiendo mucho sin dar muchos detalles. Esperemos que esto le dé una idea al OP y a otros.

Suposiciones

“Diseña una variante en … “, lo que significa que tienes la intención de usar HDR para introducir un gen mutante en el genoma de LCL.
“LCL” aquí significa líneas celulares linfoblastoides.
Mi audiencia en este momento es alguien en la academia, por lo tanto, tiene una comprensión general de la jerga de la biología molecular y cómo hacer investigación en literatura.

Advertencia rápida:
Usar CRISPR no es fácil (lo he usado). No puedo diseñar tu experimento para ti. Nadie puede darle un “protocolo exacto y repetible” para toda la ingeniería CRISPR / Cas9 en Quora o en otro lugar. No existe tal cosa.

Le voy a dar un procedimiento general para HDR-CRISPR en LCL. Tendrás que desarrollarlo por tu cuenta; Ayudaré donde pueda con lecturas y recursos sugeridos.

Instrucciones generales:

Determine en qué parte del genoma de LCL le gustaría insertar su variante con HDR. Algunas consideraciones para esto incluyen lo siguiente:

¿Vas a insertar tu variante en la versión endógena del gen, eliminando así el original? ¿O su variante va a restaurar la función de lo que había antes?
¿Va a insertar la variante en otro gen dentro del genoma, eliminando así su función, que podría detectar porque produce un fenotipo visualmente observable / medible? Esto sería análogo a la selección de antibióticos con bacterias, o la complementación funcional con aminoácidos para la levadura.

Dado que los LCL no funcionan muy bien con la lipofectamina, necesitará usar otros métodos de transfección de ADN como la nucleofección. Establece tu protocolo de nucleofección. Aquí hay uno. [1]
“Utilizamos el Lonza Nucleofector II para la entrega de ADN. Se transfectaron cinco millones de células Raji o DG-75 con plásmidos de 5 μg en cada reacción de 100 μL. La línea celular Kit V y el programa M-013 se usaron siguiendo la recomendación de Lonza. Para IMR-90, se transfectaron un millón de células con plásmidos de 5 μg en 100 μL de Solución V, con el programa T-030 o X-005 “.

Esto implica que va a introducir dos tipos de ADN: (1) plásmido circularizado que codifica su Cas9 y sgRNA que encontraría en AddGene, y (2) plásmido linealizado que contiene su variante flanqueada por secuencias de ADN complementarias a las regiones que flanquean el corte que harás con el Cas9-sgRNA.
También puede optar por aislar y purificar el Cas9 expresado de un huésped apropiado, y luego premontarlo con el sgRNA (también debe aislarse y purificarse). La PCR amplifica su variante (flanqueada por las regiones complementarias apropiadas) y la purifica. Mezclar el Cas9-sgRNA premontado con la variante amplificada por PCR y transfectar en la cepa LCL. Los protocolos podrían modificarse de los que se encuentran en otros lugares. [2]

Elija qué Cas9 va a usar para hacer su corte, luego diseñe su sgRNA (correspondiente a su Cas9) para apuntar a la ubicación del genoma que seleccionó en el Paso (1). Es posible que deba codificar para optimizar su gen Cas9. Además, debe asegurarse de que se exprese con un NLS. ¡Para las pautas de diseño de sgRNA, tengo muchas buenas recomendaciones que he usado antes (con éxito)! Aquí hay dos;

Diseño racional de sgRNA altamente activos para la inactivación génica mediada por CRISPR-Cas9
Diseño optimizado de sgRNA para maximizar la actividad y minimizar los efectos fuera del objetivo de CRISPR-Cas9

Establezca un método para detectar células / colonias que se hayan modificado con éxito para expresar su variante. Puede hacer esto al verificar la proteína con especificación de masa, su actividad particular o la falta de ella dependiendo de si activó / deshabilitó una función. También puedes hacer esto con métodos basados en ADN a través de ensayos de secuenciación y escisión como SURVEYOR. [3]

Comentarios generales:
Esto se ha hecho antes, así que te señalo aquí. [4]

La inserción de modificaciones genéticas precisas mediante herramientas de edición del genoma como CRISPR-Cas9 está limitada por la eficiencia relativamente baja de la reparación dirigida por homología (HDR) en comparación con la mayor eficiencia de la vía de unión final no homóloga (NHEJ). Para mejorar la HDR, permitiendo la inserción de modificaciones genéticas precisas, suprimimos las moléculas clave NHEJ KU70, KU80 o ADN ligasa IV mediante silenciamiento génico, el inhibidor de ligasa IV SCR7 o la coexpresión de proteínas de adenovirus 4 E1B55K y E4orf6 en un ‘semáforo’ y otros sistemas de reporteros. La supresión de KU70 y ADN ligasa IV promueve la eficiencia de HDR 4–5 veces. Cuando se coexpresó con el sistema Cas9, E1B55K y E4orf6 mejoraron la eficacia de HDR hasta ocho veces y esencialmente abolieron la actividad de NHEJ tanto en líneas celulares humanas como de ratón. Nuestros resultados proporcionan herramientas útiles para mejorar la frecuencia de modificaciones genéticas precisas en células de mamíferos.

Lo que Chu et al . Lo que hemos hecho aquí es mejorar la HDR en la línea celular de linfoma de Burkitt. Probablemente podrá encontrar información de los protocolos que utilizaron. También puede encontrar documentos útiles relacionados con HDR-CRISPR en las líneas celulares de linfoma de los que citaron este documento, y los documentos que citó este documento: Web of Science es bastante intuitivo para ese tipo de búsqueda en la literatura.

Espero que esto ayude. Avíseme si tiene preguntas más específicas. ¡Buena suerte!

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Notas al pie

[1] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc…

[2] Edición de genoma dirigida por homología de alta eficiencia en Caenorhabditis elegans utilizando complejos de ribonucleoproteína CRISPR-Cas9

[3] Ensayo de nucleasa de agrimensor – Wikipedia

[4] https://www.nature.com/nbt/journ…

biología molecularCas9CRISPR