¿Por qué las longitudes de los cebadores suelen ser de 18 ~ 25 nucleótidos?

En primer lugar, no siempre tienen esa longitud, especialmente para aplicaciones especializadas de PCR.

No soy un experto en química de PCR, pero esos ~ 20 bps son los límites de especificidad que podrá obtener haciendo una PCR. Un poco más y estás aumentando la probabilidad de problemas con estructuras secundarias, auto-recocido, etc. Dicho esto, las personas realizan PCR con cebadores de más de 100 pb de largo cuando intentan introducir una secuencia en los extremos.

Un poco más corto, y estás sacrificando la especificidad, aunque si puedes obtener una buena especificidad en una secuencia más corta, funcionará bien (los RAPD usan hexamers, por ejemplo).

Los pares de bases más cercanos al extremo 3 ‘son los más importantes (especialmente el primero); puedes visualizar esto fácilmente; la polimerasa solo necesita comenzar desde ese último par de bases. El otro extremo de la imprimación puede aletear. La falta de coincidencia de pares de bases en realidad se aprovecha regularmente para inducir mutaciones o permitir el cebado de secuencias relacionadas.

Aquí, esta figura explica lo que estoy tratando de decir:

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Una buena pregunta La respuesta simple es que se ha encontrado que funciona en muchas situaciones prácticas. Un poco más profundo Hay compensaciones y varios algoritmos que se han hecho para darles cuenta. En la práctica, ningún modelo de estos es perfecto y es una situación en la que se combinan combinaciones de razonamiento analítico y heurístico (regla general). Los cebadores deben tener las propiedades individuales correctas y también las propiedades que se aplican al par. Si se van a utilizar cebadores en la multiplexación, eso también debe calcularse. La complejidad y los detalles de la secuencia de la que se elige el objetivo son importantes. Hay alrededor de una docena de consideraciones en total. Si pudiera resolver el problema definitivamente con una sola opción, es decir, saber de antemano qué elección de cebadores funcionaría mejor en la práctica, comprendería algunas cosas más profundamente que el nivel actual.

Los cebadores deben tener 18-30 para garantizar su recocido de secuencia única y, por lo tanto, su especificidad. A medida que aumenta la longitud del cebador, disminuye el tiempo para encontrar la secuencia particular en el genoma humano. Por lo tanto, las posibilidades de encontrar la secuencia de cebador particular en el ADN son demasiado bajas en una secuencia de 18 nucleótidos.

El genoma humano contiene aproximadamente 3 mil millones de pares de bases. Los tiempos para encontrar la misma secuencia en el genoma son:

Para secuencia de 12 nucleótidos -> 196.68

Para secuencia de 18 nucleótidos -> 0.048

Sin embargo, no queremos que el cebador sea demasiado largo ya que la eficiencia del recocido disminuye con el aumento de la longitud del cebador.

Guía de diseño de cebadores para PCR

1. Longitud del cebador: se acepta generalmente que la longitud óptima de los cebadores de PCR es de 18-22 pb. Esta longitud es lo suficientemente larga para una especificidad adecuada y lo suficientemente corta como para que los cebadores se unan fácilmente a la plantilla a la temperatura de recocido “.

Esto se debe a que el cebador corto muestra mejores resultados en los experimentos de PCR que los cebadores largos.

Fácil de construir

Facil de manejar

Alta reproducibilidad

Alta especificidad y capacidad de unión al sitio ori del ADN

Los resultados son buenos.

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