La técnica de cromatografía de afinidad explota la propiedad de las biomoléculas, como las enzimas, para unirse específicamente al sustrato o cualquier grupo funcional [1].
Ejemplos:
- Enzima que se une al sustrato.
- Anticuerpo con antígeno específico.
- Hormona que se une al receptor.
Requisitos:
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- Ligandos que tienen afinidad por el sustrato.
- Matriz para sujetar el ligando.
- El sustrato que es tu molécula de interés.
- Sitio de unión alostérica.
- Purificación de un solo paso.
- Brazos espaciadores para crear espacio entre el ligando y la matriz. Si el ligando y la matriz están cerca uno del otro, entonces, debido al impedimento estérico, la molécula de interés no podría unirse al sitio de unión alostérico en el ligando.
Propiedades de la matriz:
- La matriz debe ser inerte y estable. Su propiedad no debe cambiar debido al cambio en el pH, la fuerza iónica y la temperatura durante la técnica de elución.
- La matriz debe tener múltiples sitios de unión para los ligandos. Por lo tanto, cuanto más se une el ligando a la matriz, mayor es la resolución.
- La matriz debe ser porosa para que aumente el área de superficie.
- Ejemplos de matrices son sepharose, agarosa, etc.
Propiedades de los ligandos:
- El ligando debe tener buena afinidad y especificidad por las moléculas de interés.
- El ligando debe unir la molécula de interés de manera reversible. Si la molécula se une al ligando con una afinidad muy alta, entonces las moléculas no se eluirán.
- El ligando debe tener dos sitios de unión. Uno para unirse con la matriz y el otro para unirse con la molécula de interés.
- Los dos sitios de unión no deben solaparse. Si es así, se deben usar brazos espaciadores para unir la matriz y el ligando. Los brazos espaciadores como el diaminopropanol se usan comúnmente [2].
- Ejemplos de ligandos: los ligandos de heparina se usan para aislar las fibronectinas.
Imagen [3]
Activación de la matriz:
La activación de la matriz es uno de los pasos esenciales para unir un brazo espaciador o el ligando a la matriz. Generalmente se lleva a cabo por el bromuro de cianógeno. La matriz se hace reaccionar con el bromuro de cianógeno (CNBr) a pH 11 y temperatura de 20 ° C. Se realiza una activación, a través de la reacción de acoplamiento se agregará el ligando.
Cargando la muestra:
Una vez que la columna está preparada, la muestra debe cargarse. Antes de cargar la muestra, primero equilibramos la columna con el tampón para que el pH y la fuerza iónica sean uniformes en toda la columna.
La muestra se carga en la proporción de 1:10. La muestra no unida que no tiene afinidad por el ligando se eluirá primero. Las moléculas de interés que tienen alta afinidad por el ligando se retrasarían.
Elución de la muestra:
Para eluir la muestra, utilizamos dos tipos de método. Uno es específico y el otro no es específico.
El método no específico incluye el cambio en el pH y la fuerza iónica. El cambio en el pH reduciría la afinidad de las moléculas al ligando y, por lo tanto, se eluiría. Se llama elución de cambio de pH. Misma historia para el aumento de la fuerza iónica. Estos cambios pueden llevarse a la columna utilizando un búfer.
El método específico incluye la adición de macromoléculas que pueden unirse al ligando con mayor afinidad que la molécula de interés (macromolécula como la proteína). Por lo tanto, las moléculas de interés serían reemplazadas y eluidas. También se pueden agregar tales macromoléculas que tienen mayor afinidad por la proteína o las moléculas de interés que el ligando. Entonces, las proteínas se eluirían con las macromoléculas dejando el ligando no unido en la columna.
Hay algunas modificaciones diferentes a la cromatografía de afinidad. Si se usan anticuerpos o antígenos como ligandos, entonces se conoce como cromatografía de inmunoafinidad. Ciertas proteínas tienen afinidad por los iones metálicos. En tales casos, los iones metálicos como Cu2 +, Ni2 +, Zn, Mg, etc. están unidos a la matriz, y se conoce como cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados [4].
Referencia y lecturas sugeridas:
- Janson, JC ed., 2012. Purificación de proteínas: principios, métodos de alta resolución y aplicaciones (Vol. 151). John Wiley & Sons.
- O’carra, P., Barry, S. y Griffin, T., 1974. Brazos espaciadores en cromatografía de afinidad: uso de brazos hidrófilos para controlar o eliminar los efectos de adsorción no bioespecíficos. Cartas FEBS , 43 (2), pp.169-175.
- Cuatrecasas, P. y Anfinsen, CB, 1971. Cromatografía de afinidad. Revisión anual de bioquímica , 40 (1), pp.259-278.
- Porath, J., 1992. Cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados. Expresión y purificación de proteínas , 3 (4), pp.263-281.
- Hage, DS and Cazes, J. eds., 2005. Manual de cromatografía de afinidad . CRC Press.
- Wilson, K. y Walker, J. eds., 2010. Principios y técnicas de bioquímica y biología molecular . Prensa de la Universidad de Cambridge.
Notas al pie
[1] Cromatografía de afinidad – Wikipedia
[2] Proteómica / Separaciones de proteínas – Cromatografía / Afinidad
[3] Imagen en gbiosciences.com
[4] http://molbiol.ru/forums/index.p…
