Después de identificar una secuencia de aminoácidos de anticuerpos monoclonales, ¿cómo se usa la información de la secuencia? ¿Qué hacen los científicos con esa secuencia en particular?

De vuelta en la escuela de posgrado, en el transcurso de una semana, pude secuenciar un anticuerpo, PCRé el gen y lo subcloné en un vector de expresión para poder producirlo en mi propio sistema de expresión. En estos días, las técnicas son lo suficientemente rutinarias como para que cualquiera pueda secuenciar un anticuerpo. Ahora se preguntan qué puede hacer alguien con esta información.

Vale la pena observar el ciclo de vida general de un anticuerpo y lo que le sucede a un anticuerpo monoclonal antes de que esté cerca de usarse en un ser humano. Después de seleccionar un anticuerpo con actividad hacia un antígeno específico y la célula del bazo (generalmente una célula del bazo, hay otras formas de aislar una célula huésped), entonces hay muchos pasos adicionales necesarios para preparar el MAb para su uso.

El primero es la maduración de anticuerpos. Cuando los anticuerpos se seleccionan por primera vez contra un antígeno, aún puede tener baja especificidad y selectividad. Podemos agregar diversidad genética adicional a la secuencia de codificación y luego volver a probar la actividad del anticuerpo. Aquí es donde las técnicas de evolución dirigida se vuelven extremadamente útiles; la capacidad de crear rápidamente una gran cantidad de clones y luego seleccionarlos contra una variedad de objetivos para aumentar la especificidad y mejorar selectivamente la capacidad de hacer un trabajo completo con la selección de anticuerpos. Si este trabajo no se realiza correctamente durante la etapa de descubrimiento de fármacos, pueden surgir problemas importantes más adelante durante el desarrollo tanto en la clínica, la estabilidad del fármaco y la fabricación.

Esquema de selección de anticuerpos [1]

Una vez que tenga un anticuerpo maduro, puede tomar las regiones de unión del anticuerpo y colocarlo en un andamio amigable para los humanos. Si coloca un anticuerpo de ratón en un humano, el sistema inmune humano lo reconocerá como extraño y generará una respuesta inmune. Como resultado, es importante hacer que los anticuerpos sean lo más humanos posible para evitar efectos secundarios. Hay una variedad de formas de eliminar la porción murina del anticuerpo. Todos ellos aprovechan la biología molecular para clonar los dominios de unión en los dominios constantes humanos. La forma más directa pero aún arriesgada sería intercambiar la región Fc para producir un anticuerpo quimérico. Para preservar los dominios de unión pero intercambiando tantos elementos humanos como sea posible, puede intercambiar solo las CDR para hacer un anticuerpo humanizado. Hay otras formas de evitar esto. Al utilizar una evolución dirigida utilizando técnicas basadas en ecoli o utilizando ratones humanizados, puede generar directamente anticuerpos completamente humanos que tienen una probabilidad mucho menor de causar inmunogenicidad. También puedes usar la secuencia de anticuerpos y buscar secuencias potencialmente inmunogenéticas usando una variedad de bases de datos. [2]

Puede repetir el proceso de maduración por afinidad para mejorar la estabilidad [3] Además de mejorar la capacidad de unión, los científicos también analizarán la secuencia de anticuerpos para buscar regiones inestables que causen degradación de proteínas. Además, existen andamios de anticuerpos alternativos, cada uno con diferentes estructuras, pesos moleculares, avidez y farmacocinética.

Andamios de diferentes anticuerpos [4]

Una vez que seleccionó un anticuerpo, generalmente es preferible transferir el gen de interés a líneas celulares más estables para la expresión. En términos generales, no es ideal tener anticuerpos producidos a partir de hibridomas o E. coli, ya que tienden a ser genéticamente inestables y tendrán mucha variabilidad. Además, esas células requerirán fuentes de nutrientes difíciles de obtener o riesgosas para mantenerse con vida (como suero o hidrolizados). Como resultado, es preferible pasar a una línea celular estable como CHO, NS0, levadura o plantas. Alternativamente, con algunas terapias celulares, puede introducir su gen en una célula B funcional. Esto requiere conocer la secuencia de anticuerpos y trasladarla a la nueva célula objetivo y volver a secuenciar para garantizar que el gen esté integrado de manera estable. Desde el punto de vista de la fabricación, desea asegurarse de que el anticuerpo que está produciendo sea similar al anticuerpo que diseñó originalmente.

Notas al pie

[1] Selección escalable de alto rendimiento de bibliotecas de anticuerpos sintéticos mostrados en fagos | Protocolo

[2] ¿Existe alguna herramienta para predecir la antigenicidad-inmunogenicidad de un …

[3] ¿Cómo realzo la estabilidad de la proteína?

[4] http://www.nature.com/nrclinonc/…

Depende de para qué se esté utilizando el anticuerpo monoclonal. Por ejemplo, en productos farmacéuticos, los anticuerpos a menudo se usan para suprimir una molécula natural en el cuerpo.

Por ejemplo, hay varios anticuerpos que se dirigen al factor de necrosis tumoral alfa, una citocina involucrada en el proceso inflamatorio. Remicade y Humira son ejemplos. En el caso de Remicade, los científicos inyectaron TNF-α en colonias de células de ratón para crear anticuerpos. Después de secuenciar los anticuerpos resultantes, sustituyeron algunos segmentos de aminoácidos que son específicos de anticuerpos de ratón por equivalentes humanos, creando lo que se conoce como anticuerpo “quimérico”. Luego insertan el ADN de este anticuerpo en las células de levadura, haciendo que la levadura produzca los anticuerpos. Purifique los anticuerpos resultantes, véndalos a las farmacias y tendrá un medicamento de gran éxito que se une al TNF-α, evitando que se una a los receptores de un paciente.

Humira es muy similar, aunque ha habido más edición de la proteína del anticuerpo para hacerla completamente “humanizada”, es decir, es menos probable que el sistema inmunitario de una persona la reconozca como extraña. Hay medicamentos como Tysabri y Entyvio que se unen a las integrinas específicas que median la respuesta del sistema inmune. Existen muchas otras variedades de anticuerpos monoclonales con usos terapéuticos.

En general, los anticuerpos permiten a los científicos encontrar estructuras de proteínas que se unirán a una proteína determinada. Cimzia es un ejemplo de un fármaco anti-TNF-α que en sí mismo no es un anticuerpo. Un anticuerpo consta de dos partes: la parte que se une a una molécula y la parte que le indica al sistema inmunitario. Cimzia tiene dos de las partes de unión unidas, de modo que se unirá al TNF-α pero no indicará al sistema inmunitario como lo haría un anticuerpo verdadero. Pero la secuencia de aminoácidos para la parte de unión aún proviene del análisis de anticuerpos de animales (probablemente ratones).

Si tenemos una idea básica de cómo funcionan los anticuerpos en el cuerpo, esto es más fácil de entender. En el sistema inmune, los anticuerpos (estructuras de proteínas, hechas de secuencias de aminoácidos como lo están todas las proteínas) deambulan en espera de unirse al antígeno correspondiente de una sustancia extraña. Luego, la sustancia extraña identificada adjunta es destruida, cargada y / o puesta en cuarentena por otras partes del sistema inmune (nota: esto está MUY simplificado).

La mayoría de los anticuerpos en el sistema inmune son parte de sistemas policlonales (multipartes). La ventaja de los anticuerpos monoclonales que tienen anticuerpos proteicos conocidos (es decir, usted sabe a qué antígeno se unirá, que es bastante difícil de evaluar en sí mismo), es que puede crear una investigación específica sobre esas partes del sistema inmunitario. y, lo que es más importante, los tratamientos dirigidos a los antígenos.

Una de las grandes áreas que utilizan esta tecnología es la investigación del cáncer. Actualmente, la quimioterapia, por ejemplo, envenena todas las células, sanas y cancerosas, y depende de las células sanas para recuperarse lo suficiente como para no matarlo o volverse canceroso por la necesidad de replicarse rápidamente (ambos son “efectos secundarios” muy comunes). Con los anticuerpos monoclonales dirigidos, puede, por ejemplo, crear estas células en un laboratorio, comúnmente ahora con células humanas emparejadas con bazo de ratón, creo, y unir un veneno dirigido a las células. Luego, las células encuentran y se adhieren solo a las células cancerosas (el único antígeno al que pueden unirse), y luego son destruidas por el apego y limpiadas por el sistema inmunológico saludable.

Piense en ello como la misión de ataque quimio. Se está utilizando para varios tipos de cáncer, y ya existen varios tratamientos para otras enfermedades autoinmunes, como la artritis reumatoide, el asma, la colitis ulcerosa, la enfermedad de Crohn y algunos para prevenir el rechazo de algunos trasplantes de órganos. Los medicamentos que terminan en -mab son anticuerpos monoclonales terapéuticos.

Esto está extremadamente simplificado, pero debería responder la pregunta en forma general.

Saludos cordiales,
Alexandra

Si está preguntando sobre el descubrimiento de fármacos en particular, la secuencia de un anticuerpo en sí no le dice mucho. En productos farmacéuticos, solo cuando un anticuerpo muestra potencial de actividad del fármaco (bloquea o suprime un objetivo conocido) se secuenciará, una vez que tenga la secuencia, puede construir bibliotecas de mutaciones en la secuencia para identificar anticuerpos que tienen una actividad más fuerte (maduración de afinidad) y luego mute el anticuerpo para encontrar uno que tenga la antigenicidad humana más baja (humanización), puede buscar las 2 palabras clave para obtener más información sobre el proceso.