De vuelta en la escuela de posgrado, en el transcurso de una semana, pude secuenciar un anticuerpo, PCRé el gen y lo subcloné en un vector de expresión para poder producirlo en mi propio sistema de expresión. En estos días, las técnicas son lo suficientemente rutinarias como para que cualquiera pueda secuenciar un anticuerpo. Ahora se preguntan qué puede hacer alguien con esta información.
Vale la pena observar el ciclo de vida general de un anticuerpo y lo que le sucede a un anticuerpo monoclonal antes de que esté cerca de usarse en un ser humano. Después de seleccionar un anticuerpo con actividad hacia un antígeno específico y la célula del bazo (generalmente una célula del bazo, hay otras formas de aislar una célula huésped), entonces hay muchos pasos adicionales necesarios para preparar el MAb para su uso.
El primero es la maduración de anticuerpos. Cuando los anticuerpos se seleccionan por primera vez contra un antígeno, aún puede tener baja especificidad y selectividad. Podemos agregar diversidad genética adicional a la secuencia de codificación y luego volver a probar la actividad del anticuerpo. Aquí es donde las técnicas de evolución dirigida se vuelven extremadamente útiles; la capacidad de crear rápidamente una gran cantidad de clones y luego seleccionarlos contra una variedad de objetivos para aumentar la especificidad y mejorar selectivamente la capacidad de hacer un trabajo completo con la selección de anticuerpos. Si este trabajo no se realiza correctamente durante la etapa de descubrimiento de fármacos, pueden surgir problemas importantes más adelante durante el desarrollo tanto en la clínica, la estabilidad del fármaco y la fabricación.
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Esquema de selección de anticuerpos [1]
Una vez que tenga un anticuerpo maduro, puede tomar las regiones de unión del anticuerpo y colocarlo en un andamio amigable para los humanos. Si coloca un anticuerpo de ratón en un humano, el sistema inmune humano lo reconocerá como extraño y generará una respuesta inmune. Como resultado, es importante hacer que los anticuerpos sean lo más humanos posible para evitar efectos secundarios. Hay una variedad de formas de eliminar la porción murina del anticuerpo. Todos ellos aprovechan la biología molecular para clonar los dominios de unión en los dominios constantes humanos. La forma más directa pero aún arriesgada sería intercambiar la región Fc para producir un anticuerpo quimérico. Para preservar los dominios de unión pero intercambiando tantos elementos humanos como sea posible, puede intercambiar solo las CDR para hacer un anticuerpo humanizado. Hay otras formas de evitar esto. Al utilizar una evolución dirigida utilizando técnicas basadas en ecoli o utilizando ratones humanizados, puede generar directamente anticuerpos completamente humanos que tienen una probabilidad mucho menor de causar inmunogenicidad. También puedes usar la secuencia de anticuerpos y buscar secuencias potencialmente inmunogenéticas usando una variedad de bases de datos. [2]
Puede repetir el proceso de maduración por afinidad para mejorar la estabilidad [3] Además de mejorar la capacidad de unión, los científicos también analizarán la secuencia de anticuerpos para buscar regiones inestables que causen degradación de proteínas. Además, existen andamios de anticuerpos alternativos, cada uno con diferentes estructuras, pesos moleculares, avidez y farmacocinética.
Andamios de diferentes anticuerpos [4]
Una vez que seleccionó un anticuerpo, generalmente es preferible transferir el gen de interés a líneas celulares más estables para la expresión. En términos generales, no es ideal tener anticuerpos producidos a partir de hibridomas o E. coli, ya que tienden a ser genéticamente inestables y tendrán mucha variabilidad. Además, esas células requerirán fuentes de nutrientes difíciles de obtener o riesgosas para mantenerse con vida (como suero o hidrolizados). Como resultado, es preferible pasar a una línea celular estable como CHO, NS0, levadura o plantas. Alternativamente, con algunas terapias celulares, puede introducir su gen en una célula B funcional. Esto requiere conocer la secuencia de anticuerpos y trasladarla a la nueva célula objetivo y volver a secuenciar para garantizar que el gen esté integrado de manera estable. Desde el punto de vista de la fabricación, desea asegurarse de que el anticuerpo que está produciendo sea similar al anticuerpo que diseñó originalmente.
Notas al pie
[1] Selección escalable de alto rendimiento de bibliotecas de anticuerpos sintéticos mostrados en fagos | Protocolo
[2] ¿Existe alguna herramienta para predecir la antigenicidad-inmunogenicidad de un …
[3] ¿Cómo realzo la estabilidad de la proteína?
[4] http://www.nature.com/nrclinonc/…