Supongamos que la tarea consistiera en identificar en un lago todos los diferentes tipos de peces, así como su abundancia relativa. Análogamente, el ARNr 16S (ARN ribosómico 16S – Wikipedia) y la secuenciación metagenómica (Metagenómica – Wikipedia) intentan hacer lo mismo para las comunidades microbianas en diversos hábitats. 16S rRNA es similar a hacerlo con un montón de cañas de pescar, es decir, un conjunto de PCR (reacción en cadena de la polimerasa – Wikipedia) Primer (biología molecular) – Wikipedia específica para genes bacterianos 16S rRNA definidos, mientras que la secuencia metagenómica es similar a una red de arrastre, secuenciación de alto rendimiento de genes microbianos completos, incluso genomas. Ambos comienzan con el ADN extraído de una muestra seguido de un mapeo a bases de datos de referencia y anotaciones (ver más abajo de 1).
En ese sentido, 16S rRNA es más una ‘ huella digital ‘ (2) para especies bacterianas, mientras que la metagenómica analiza una muestra biológica (caca humana, hisopo de piel, etc.) o ambiental (suelo, acuífero, etc.) dada de manera más exhaustiva y completa y así genera una instantánea más precisa no solo de las bacterias (3) sino también de las arqueas, eucariotas, hongos, protistas y virus (2) presentes en ella.
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Otros problemas con el análisis 16S rRNA incluyen
- Mayor margen para introducir sesgos desde
- Ciertas secuencias de 16S rRNA pueden amplificarse de manera más eficiente en comparación con otras, ya que las diferentes especies bacterianas transportan diferentes números de genes de 16S rRNA (4), mientras que los números de copia ni siquiera se conocen para muchas especies, especialmente aquellas encontradas durante los análisis de microbiomas humanos ya que muchas de estas especies son novedosas, no se han cultivado y es probable que sean ‘no cultivables’ utilizando técnicas bacteriológicas estándar.
- Los productos de amplificación quimérica pueden sesgar los resultados (5), pero el campo del microbioma está plagado de una adherencia débil a soluciones técnicas relativamente fáciles que podrían evitar que tales artefactos ocurran en primer lugar (6).
- No se puede usar para identificar a nivel de especie, ya que muchas especies bacterianas tienen genes idénticos 16S rRNA, por ejemplo, algunas especies de Anthrax (2).
El principal problema con la metagenómica es el costo, ya que todavía es bastante prohibitivo.
La secuenciación 16S rRNA y la metagenómica comparten muchos pasos críticos para introducir sesgos
Sin embargo, debatir los méritos relativos del ARNr 16S frente a la metagenómica arriesga perder el bosque para los árboles, ya que ambos enfoques comparten muchos pasos críticos de introducción de sesgo (ver más abajo de 7).
- Estos incluyen el diseño del estudio (3), la recolección de muestras, el procesamiento, el almacenamiento, la extracción y secuenciación de ADN, todo lo cual puede introducir una variedad de sesgos y errores además de los inherentes a las dos técnicas.
- Las diferencias en la recolección de muestras (8, 9), el procesamiento (10), el transporte, el almacenamiento (11, 12, 13) y la extracción de ADN (14, 15) pueden cambiar los resultados del microbioma.
- Incluso diferentes plataformas de secuenciación pueden arrojar resultados diferentes de las mismas muestras (16).
- Las bases de datos de referencia no solo son incompletas (17), sino que los modelos computacionales utilizados comúnmente varían en sensibilidad y precisión (18).
- Tanto el 16S rRNA como la metagenómica también comparten otro error común a cualquier campo científico en rápida expansión, a saber, supuestos problemáticos que subyacen a los complejos enfoques estadísticos necesarios para el análisis de la colosal cantidad de datos generados por tales técnicas. Por ejemplo, un enfoque comúnmente utilizado, Rarefaction (ecología) – Wikipedia, tiene el potencial de sesgar dramáticamente las tasas de falsos positivos y falsos negativos (19).
- En otras palabras, incluso cuando el campo del microbioma explota y, por lo tanto, está sujeto a una constante innovación tecnológica, las medidas críticas de control de calidad, como el desarrollo de protocolos estandarizados, no han seguido el ritmo (20, 21). Dado que diferentes estudios publicados usan diferentes métodos, los resultados tampoco se pueden comparar entre los estudios (17, 22).
- La mayoría de los estudios de microbiomas consisten en un pequeño número de sujetos . Dichos estudios tienen un poder estadístico inherentemente pobre, lo que significa que es difícil ser concluyente sobre una hipótesis particular. Después de todo, cuando la dieta (23) y la ubicación (24) cambian drásticamente las lecturas instantáneas de la composición de microbiomas de un solo individuo, es lógico que cada estudio de microbiomas se considere un dato independiente y, sin embargo, se ha convertido en estándar extrapolar y exagerar los resultados de un estudio a pequeña escala a un campo completo o incluso a la fisiología humana misma (7).
- Actualmente, muchos estudios de microbiomas también hacen un trabajo extremadamente pobre al explicar los factores de confusión al comparar las diferencias de microbiomas entre dos grupos de individuos, independientemente del método utilizado para evaluarlo en primer lugar.
- Un ejemplo ilustrativo de tales errores, un estudio (25) informó que los jugadores de rugby (n = 40) tienen microbiomas más diversos en comparación con los controles de la misma edad (n = 23, 23). Los autores y la prensa popular interpretaron esta aparente diferencia como prueba de que “el ejercicio aumenta la diversidad microbiana intestinal en los humanos ” (25). De Verdad? ¿El ejercicio fue la única diferencia entre esos dos grupos? ¿No es la dieta, no un contacto más extenso con el suelo, por mencionar solo dos diferencias plausibles entre los jugadores de rugby y los controles de la misma edad (7)?
- En otras palabras, muchos estudios de microbiomas continúan cometiendo el error fatal de combinar correlación con causalidad .
- Las réplicas de muestras son vitales para atestiguar la solidez de los enfoques experimentales, especialmente para técnicas biológicas moleculares extremadamente sensibles como la secuenciación de ARNr 16S o la metagenómica. La sensibilidad ampliamente expandida aumenta en gran medida la carga de separar la señal del ruido (26). El paso más crucial para el control de calidad, la replicación , es decir, analizar la misma muestra varias veces, se vuelve crítico para ayudar a discriminar mejor la señal del ruido. Actualmente, la investigación de microbiomas tiende a descuidar lamentablemente las réplicas de muestras (ver la tabla a continuación de 27).
Prosser acerta con razón el problema crítico de los números de muestra y replica en su cabeza de esta manera (27),
“ Por el momento, si midiera la altura de un inglés, un estadounidense, un australiano y un africano y luego utilizara los datos para postular las formas en que el continente determinaba la altura, sería ridiculizado correctamente. Si tuviera que tomar una sola muestra fecal de cada uno de los mismos individuos y realizar una secuenciación masiva, paralela, de alto rendimiento, 454 para generar listas de secuencias, abundancias relativas de diferentes grupos filogenéticos y gráficos circulares, y usaría estos datos para postular el continente diferencias asociadas en las comunidades microbianas intestinales, es probable que el artículo se publique en una de las revistas de ciencia general de más alto perfil. Ya hay varios precedentes de esto y, como comunidad, deberíamos estar avergonzados ”.
Siete años después del comentario anterior sobre esta situación, poco ha cambiado con respecto a este status quo, incluso a medida que la investigación de microbiomas se ha expandido enormemente, ingresando a todas y cada una de las áreas de investigación sobre fisiología y enfermedad humana.
Bibliografía
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Gracias por el R2A, Jai Padmakumar.
