La técnica de transferencia Southern se utiliza para identificar la secuencia de ADN específica presente en la muestra de ADN. La aplicación principal de esta técnica es la toma de huellas digitales de ADN para identificar al criminal, la prueba parental, el estudio de enfermedades genéticas, etc. La técnica también se llama hibridación del sur.
Vamos a ver cómo funciona.
La transferencia Southern emplea primero la separación de las bandas de ADN a través de la electroforesis en gel. El ADN que se trata con endonucleasas de restricción se fragmentará en fragmentos de diferentes tamaños. Una vez que las bandas se separan, las bandas se transfieren a la vaina de nitrocelulosa . Se realiza simplemente colocando papel de nitrocelulosa en el gel, sobre el cual se colocan múltiples papeles de filtro. El papel de filtro comenzaría a secar / absorber la humedad del gel, lo que generaría una acción capilar para mover el tampón hacia arriba.
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Como el papel de nitrocelulosa está en contacto directo con el gel, el movimiento del tampón en la dirección ascendente imprimirá / transferirá las bandas al papel de nitrocelulosa.
Imagen [1]
El papel de nitrocelulosa tiene poros de tamaño muy pequeño y, por lo tanto, el ADN no puede moverse más y permanece unido al papel de nitrocelulosa.
Para confirmar que no queda ADN en el gel de agarosa, se puede usar radiación UV.
Ahora, el ADN está en el papel de nitrocelulosa. El ADN se somete a un tratamiento alcalino para la desnaturalización. El ADN se fija a la vaina de nitrocelulosa proporcionando calor a una temperatura de 80 ° C durante 2 horas. Si se usó una placa de nylon, entonces se puede usar UV para fijar el ADN.
Una vez que se fija el ADN, la hibridación puede llevarse a cabo utilizando una sonda. Las sondas son generalmente oligonucleótidos cortos radiomarcados que nos darían la idea sobre la presencia de una secuencia específica. Le sigue un lavado posterior a la hibridación en el que la condición es muy específica, de modo que la sonda no específica no se une al ADN.
Las condiciones de hibridación y lavado son críticas. Si la sonda y el objetivo son 100% idénticos en secuencia, entonces se puede llevar a cabo una hibridación de alta rigurosidad. La rigurosidad está determinada por la temperatura de hibridación y la concentración de sal en el tampón de hibridación (la temperatura alta y la sal baja son más estrictas ya que solo los híbridos perfectamente compatibles serán estables). Para las sondas que no coinciden completamente con el objetivo (una sonda menos específica ), la rigurosidad debe reducirse a un nivel que permita la formación de híbridos imperfectos. Si la rigurosidad de la hibridación (o lavado) es demasiado baja, entonces la sonda puede unirse a demasiadas secuencias para ser útil [2].
La presencia de la sonda se detecta mediante autorradiografía.
Referencia y lecturas sugeridas
- Primrose, SB y Twyman, R., 2013. Principios de manipulación genética y genómica . John Wiley & Sons.
- Brown, TA, 2016. Clonación génica y análisis de ADN: una introducción . John Wiley & Sons.
- Southern blot – Wikipedia
- Hibridación
Notas al pie
[1] Imagen en mun.ca
[2] Hibridación
