PCR-reacción en cadena de la polimerasa
En pocas palabras, es un protocolo utilizado para amplificar una secuencia particular de ADN de interés de cualquier fuente, y esto se basa en la capacidad de la ADN polimerasa para sintetizar una nueva cadena complementaria de ADN. Y para elegir la secuencia de interés para que la ADN polimerasa actúe, se requiere un cebador para guiar la ADN polimerasa para agregar el primer nucleótido para comenzar el proceso de replicación.
COMPONENTES REQUERIDOS PARA PCR:
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Plantilla de ADN: es la secuencia de ADN que se utiliza como secuencia de ADN original para amplificar la secuencia de interés.
Primers: actúa como guía para la ADN polimerasa. Es una pieza corta de ADN monocatenario y permite que la ADN polimerasa agregue su primer nucleótido a la secuencia de ADN deseada. Hay dos tipos de cebadores cebadores hacia adelante y hacia atrás.
dNTP (trifosfatos de desoxinucleótidos): estas son las unidades individuales de las bases A, T, G, C. Estos son utilizados por la ADN polimerasa para construir una nueva cadena de ADN.
ADN polimerasa: es una enzima que sintetiza la cadena complementaria de la secuencia deseada de ADN. No puede comenzar a sintetizar por sí solo. Puede agregar nucleótidos en la dirección 5′-3 ‘a la cadena preexistente, por lo tanto, usamos cebadores para iniciar la replicación.
PROTOCOLO:
Desnaturalización: el ADN de cualquier fuente se desnaturaliza primero (la naturaleza bicatenaria se destruye) al proporcionar temperaturas elevadas de aproximadamente 95 ° C que conducen a la separación de la cadena.
Recocido: también conocido como etapa de cebado de cebado. los cebadores están unidos al ADN en la secuencia de interés. Los cebadores están diseñados de tal manera que son complementarios a la secuencia de interés en el ADN parental. El cebador directo se une a la secuencia de ADN con la secuencia 3′-5 ‘y el cebador inverso se une a la secuencia de ADN con la secuencia 5′-3’.
Extensión: ahora la ADN polimerasa entra en acción y comienza a agregar nucleótidos para replicar el ADN. En la PCR se usa un tipo especial de ADN polimerasa y tiene la capacidad de resistir altas temperaturas. La ADN polimerasa más utilizada es la ADN polimerasa Taq (aislada de Thermis aquaticus ), la ADN polimerasa pfu (aislada de Pyrococcus furiosus) es ampliamente utilizada debido a su alta fidelidad al copiar ADN.
Amplificación: El ciclo mencionado anteriormente se repite una y otra vez para lograr los amplicones de la secuencia deseada de ADN.