Las diferentes enzimas de restricción son óptimamente activas en tampones con diferentes concentraciones de sal y pueden preferir diferentes cationes (generalmente sodio o potasio) y aniones (cloruro o acetato). Todos los tampones de digestión tienen DTT (ditiotreitol) que reduce los disulfuros, evitando que las cisteínas de diferentes proteínas se entrecrucen e interrumpan su estructura y actividad. Todos tienen una fuente de iones de magnesio que, debido a su tamaño y carga positiva, ayudan a estabilizar el esqueleto de fosfato de ADN cargado negativamente cuando la proteína se une al ADN. Todos tienen Tris, un agente tamponador común que funciona bien en rangos de pH fisiológicos. Esto deja solo la concentración de sal y la composición para ajustar.
Eche un vistazo a los cuatro amortiguadores NEB principales y notará que son casi idénticos, excepto por diferentes concentraciones de sal y composiciones de iones:
- 1X NEBuffer 1: 10 mM Bis-Tris-Propane-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol, pH 7.0 @ 25 ° C
- 1X NEBuffer 2: NaCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, MgCl2 10 mM, Ditiotreitol 1 mM, pH 7.9 @ 25 ° C
- 1X NEBuffer 3: NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, Ditiotreitol 1 mM, pH 7.9 @ 25 ° C
- 1X NEBuffer 4: acetato de potasio 50 mM, Tris-acetato 20 mM, Acetato de magnesio 10 mM, Ditiotreitol 1 mM, pH 7.9 @ 25 ° C
Las diferencias se pueden resumir como:
- ¿Qué es un factor de crecimiento en biología?
- ¿Cómo se convierten las proteínas transmembrana en transmembrana?
- ¿Podemos fabricar 50s rRNA a partir de 60s rRNA subunit?
- ¿Hay alguna forma de alargar los telómeros o al menos evitar que se acorten?
- ¿Cómo están involucradas las histonas en la transcripción del ADN?
- El tampón 1 no tiene / tiene poca sal y un pH ligeramente más bajo (7.0) y, por lo tanto, utiliza el agente tamponador de rango más amplio Bis-Tris-Propane-HCl en lugar de Tris.
- El tampón 2 tiene sal media (NaCl 50 mM).
- El tampón 3 tiene un alto contenido de sal (NaCl 100 mM).
- El tampón 4 tiene sal media (acetato de potasio 50 mM). También usa acetato en lugar de aniones de cloruro y potasio en lugar de cationes de sodio.
Notará la misma tendencia para los amortiguadores de enzimas de restricción de otras compañías. Entonces, la pregunta puede simplificarse a: ¿Por qué algunas enzimas funcionan mejor en altas o bajas concentraciones de sal y con diferentes cationes / aniones?
La respuesta corta es que los iones tienen un efecto tremendo en las interacciones intra e intermoleculares de una proteína en solución , ya sea que se pliegue en una conformación activa, si y con qué fuerza se une al ADN, y si permanece soluble en absoluto. Las interacciones entre la superficie de la proteína y el ion dependen no solo de la concentración sino también del tamaño / densidad de carga y forma. Por ejemplo, los iones de sodio pueden interactuar con pequeñas bolsas en la superficie de la proteína donde los iones de potasio son demasiado grandes para caber. Los cationes en particular pueden ser importantes para estabilizar las interacciones de proteínas con la cadena principal de ADN cargada negativamente, cuya ausencia puede hacer que la unión de proteína-ADN sea demasiado débil para la actividad.
Debido a que generalmente no tenemos una imagen perfecta de la carga, la forma y la dinámica de la superficie de una proteína, y porque incluso si estamos cerca de una, la física sigue siendo muy complicada, es difícil predecir exactamente qué efecto tiene la concentración de sal y La composición iónica va a tener sobre la actividad proteica. Afortunadamente, no tenemos que entender todos los detalles de la química de la superficie para realizar ensayos de actividad y determinar las condiciones óptimas del tampón. Eso es esencialmente lo que se hace para crear un gráfico de búfer; Se prueban diversas enzimas para determinar la actividad de ADNsa en cuatro condiciones diferentes de tampón y se cuantifican los resultados, presumiblemente por la intensidad de las bandas en un gel, y se informan.
