La escalera también me parece bastante borrosa, así que tendería a sospechar que tiene algo que ver con el funcionamiento del gel, como ya sugirió Jibin … parece más un gel “demasiado rápido” que un “gel no fijado”. para mí, pero algo en ese sentido.
Sin embargo, aparte de cómo ha funcionado, la banda es bastante débil. También puede ajustar la tinción del gel (¿empapa el gel en etidio después de correr o lo incorpora en los geles moldeados?) O la cantidad de tiempo que lo expone para tomar una fotografía en su documento de gel para optimizar esto, pero sospecho que te detuviste aquí en este momento de exposición porque recibías imágenes explotadas desde la parte superior de los pozos, donde puedes ver mucha fluorescencia. (Puede evitar esto, si desea tomar un tiempo de exposición más largo, empujando la parte superior de los pozos hacia arriba para que queden fuera de la imagen, o cortándolos con una cuchilla de afeitar para deshacerse de ellos de esa manera )
Sin embargo, esa banda enorme en la parte superior de los pozos es probablemente ADN genómico, dado que usted dijo que esto es de una colonia PCR, y eso me hace pensar que algo no salió bien con la PCR en sí. Puede intentar usar menos de su plantilla, especialmente para PCR de colonias, las células / polisacáridos / sustancia celular pueden inhibir la reacción. También puede intentar optimizar su PCR: ¿cuántos ciclos ha ejecutado? ¿temperatura? Concentración de DMSO?
Realizo mis propios PCR de colonias en Streptomyces, no en Burkholderia, sino solo en un protocolo de muestra: tomar 4-5 colonias, o la cantidad equivalente de un césped de células, con una punta de pipeta estéril y poner en 100 ul de DMSO al 50%; calentar a 60 ° C durante 20 minutos para comenzar a abrir las celdas; girar brevemente a los restos de pellets; tomar 5 ul en una reacción de PCR de 50 ul; incluya un paso inicial de desnaturalización más largo de 10 minutos (en lugar de 2) para ayudar a romper las células para que se abran aún más. Realice una PCR de gradiente si no funciona bien la primera vez: las especies Streppy son ridículamente ricas en GC, no sé si Burkholderia tiene algunos de los mismos problemas, o diseña cebadores ligeramente más largos o diferentes si aún no lo hace trabajo.
Además, si esto es solo para la clonación de rutina, y no para verificar mutantes, en realidad, a menudo también para verificar mutantes, creo que vale la pena hacer incluso una preparación de ADN genómico rápida y sucia, en lugar de hacer una PCR de colonias. Una preparación de ADN genómico en su cepa de tipo salvaje le durará para siempre: diluya 1: 100 para usar en PCR, de lo contrario, se encontrará con los mismos problemas de tener demasiado ADN, y es un gran ahorro de tiempo a largo plazo, En mi humilde opinión. Usamos un kit rápido, aunque si su laboratorio no tiene ninguno de esos, siempre existen los métodos tradicionales con un poco de extracciones de fenol divertidas … 🙂
¡Buena suerte!
