La técnica de microscopía de fluorescencia resuelve el problema de los límites de difracción en la microscopía óptica regular. Cuando intentamos visualizar moléculas individuales de nanoescala, como proteínas, a través de microscopía óptica, la luz de cada fuente de luz difracta y se superpone para formar una imagen difusa. Necesitamos que el sujeto que estamos observando tenga una resolución significativamente menor (menos y más fuentes de luz dispersas en la molécula) para que la difracción de la luz juegue un papel insignificante en la resolución.
FM emplea la iluminación secuencial de encendido y apagado (fluorescencia diferencial) de cada molécula a escala nanométrica del sujeto, graba las imágenes de este sujeto con diferentes patrones de fluorescencia y promedia estas imágenes para producir una imagen con una resolución mucho más alta que las individuales. Por lo tanto, claramente, hay un promedio espacial y temporal involucrado aquí.
Hay compensaciones entre disminuir el tiempo entre cada imagen capturada y aumentar el número de moléculas individuales de las cuales se capturan las imágenes. Intervalos de tiempo más cortos pueden no contribuir a la resolución si no hay suficientes determinantes espaciales; de manera similar, una mayor contribución espacial puede ser perjudicial en los casos en que la molécula está en movimiento y, por supuesto, en los casos en que se alcanza el límite de difracción. Esto último es complicado, ya que el espaciamiento de las moléculas no puede ser mayor que la mitad de la resolución deseada, pero no puede estar lo suficientemente cerca como para alcanzar el límite de difracción. Por último, la alta resolución de tiempo y espacio solo conducirá a un promedio de las imágenes de tal manera que se pueda perder la resolución final.
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