En primer lugar, realmente no hay “cebadores 3 ‘”. Hay un cebador directo y un cebador inverso, los cuales recogen 5 ‘-> 3’ en su respectiva cadena. Esta es una de las cosas que hace que la PCR sea tan poderosa.
Si va a usar una cartilla, generalmente necesita conocer el contenido de la secuencia de flanqueo. Si no conoce la secuencia de flanqueo en su especie, puede mirar la secuencia de flanqueo en una especie estrechamente relacionada y diseñar un cebador ligeramente degenerado, pero esto no siempre funciona. Hay bastantes conjuntos de cebadores “universales” en la literatura (uno que viene a la mente es el COI mitocondrial para insectos, ver ¿Son los cebadores de ADN “universales” realmente universales?) Que se basan en la conservación de la secuencia flanqueante entre especies. A veces, como ha mencionado Tushar Singh, puede diseñar cebadores degenerados a partir de la secuencia de proteínas y probarlos.
Sin embargo, una posibilidad maravillosa que viene del reino de la secuenciación es el uso de un solo manual. Dado un poco de ADN genómico, o BAC, o plásmido, etc., y un único cebador, puede secuenciar el ADN comenzando en el extremo 3 ‘de su cebador directo. Una vez que tenga los datos de secuencia, puede diseñar un nuevo cebador directo que comience en algún lugar a 3 ‘de su cebador anterior. Esta técnica se conoce como Primer Walking.
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Finalmente, hay ocasiones, especialmente en la secuenciación de próxima generación (NGS), en las que no necesita conocer la secuencia de su inserción para secuenciarla, pero aún necesita cebadores. Toda la magia necesaria para que este trabajo suceda durante la preparación de la biblioteca:
1) Corte el ADN y posiblemente seleccione el tamaño
2) Ligar un adaptador con secuencia conocida a un extremo de los fragmentos de inserción
3) Opcionalmente, unir un adaptador diferente con secuencia conocida al otro extremo de los fragmentos de inserción
4) PCR en otro adaptador (o par de adaptadores) para maximizar la cantidad de insertos ligados correctamente
5) Secuencia usando un cebador (o par de cebadores) basado en las secuencias de los adaptadores
Básicamente, está agregando una secuencia conocida a una secuencia desconocida, y la está usando para diseñar su PCR y / o cebadores de secuenciación (tanto hacia adelante como hacia atrás para la secuencia del extremo emparejado (PE)).
