En pocas palabras, las nucleasas Cas9 actúan causando roturas de doble cadena en el ADN complementario. La mayoría de estas roturas se reparan mediante recombinación homóloga (que utiliza efectivamente el otro cromosoma homólogo para reparar perfectamente la rotura), mientras que una minoría se repara mediante una unión final no homóloga (NHEJ), que a menudo elimina o cambia las secuencias en la rotura. Los sitios de corte Cas9 reparados por NHEJ son aquellos que resultan en secuencias “deshabilitadas”, ya que han incorporado algún tipo de mutación.
Las secuencias se pueden agregar haciendo uso de la vía de FC: si flanquea el ADN que desea agregar mediante las secuencias presentes a cada lado del sitio de corte, la célula a veces usará su construcción de objetivo para reparar el corte a través de HR. Esto solucionará la ruptura e insertará su ADN de elección.
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