El enfoque isoeléctrico es una técnica que se utiliza para separar las proteínas en función de su punto isoeléctrico. El punto isoeléctrico se puede definir como el valor de pH al cual la carga neta en la proteína es cero. Por lo tanto, no se movería aunque se aplique el campo eléctrico.
El enfoque isoeléctrico requiere un gradiente de pH estable. Para producir un gradiente de pH, se usan anfolitos. Las inmobulinas también se usan para generar un gradiente de pH estable. Puede haber más de 300–800 moléculas de anfolitos para producir un gradiente de pH. Los anfolitos se consideran muchas veces como las moléculas transportadoras que facilitarían el movimiento de las moléculas de proteína a su pH isoeléctrico.
El gradiente de pH se forma en el gel compuesto de agarosa o poliacrilamida. El tamaño de poro del gel se mantiene grande. El gran tamaño de los poros garantiza un fácil movimiento de las moléculas de proteína a través del gel hacia sus valores de pI. Por lo tanto, la separación aquí se basa en el valor de pI, no en la masa o la forma de la proteína.
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La tira de gradiente de pH disponible comercialmente (tiras de IPG: tiras de gradiente de pH inmovilizado [1]) de enfoque isoeléctrico tiene un rango de pH de 3 a 10. También están disponibles tiras de pH de rango estrecho, que varían de pH 3 a 5, 4 a 6, 5 a 7, etc. Las tiras de rango estrecho se utilizan para una mejor resolución en el caso de que la diferencia entre los valores de pI de cualquiera de las dos proteínas de la muestra no sea mucha.
El enfoque isoeléctrico, a diferencia de SDS-PAGE, es un sistema horizontal. El sistema horizontal tiene muchos beneficios:
- Como el sistema funciona en un campo eléctrico alto, es decir, 300 voltios, es seguro tener un sistema horizontal en lugar del sistema vertical.
- La muestra se carga cerca de su punto isoeléctrico aproximado en lugar de extremos extremos del gel. Por lo tanto, la carga de la muestra se hace más fácil en el caso de una cámara electroforética horizontal abierta.
- Debido al alto campo eléctrico, se genera una gran cantidad de calor. Por lo tanto, se requiere un sistema de enfriamiento y el sistema horizontal lo hace más fácil.
El enfoque isoeléctrico a menudo se une a una unidad electroforética automática programable. El gradiente ácido de la tira se mantiene hacia el ánodo, y el gradiente básico se mantiene hacia el cátodo.
Imagen [2]
Cuando se proporciona el voltaje, las proteínas comenzarán a migrar hacia su pH isoeléctrico. A menudo se mueven de un lado a otro hasta que no se obtenga el pH isoeléctrico perfecto. Las proteínas se condensan o se concentran, en bandas afiladas en el gradiente de pH en sus valores de pI característicos individuales [3] [4].
Sin embargo, hay un demérito. Cuando se proporciona el voltaje durante un período más largo, el gradiente de pH comienza a desplazarse hacia el extremo catódico. Esto conduce a la formación de una meseta y la separación no es eficiente. Por lo tanto, es aconsejable tener el mínimo tiempo de ejecución posible.
Existen 3 métodos para la carga de muestras: rehidratación pasiva en gel con muestra, rehidratación activa en gel con muestra o carga en copa de la muestra después de la rehidratación IPG [5].
Además, la carga de la muestra se realiza colocando un algodón / celulosa empapado con la muestra en la tira de pH. La otra forma de cargar la muestra es usando una tira de celulosa que tiene de 26 a 52 agujeros. Estas tiras de muestra se pueden colocar en la tira de pH y luego se carga la muestra. Se pueden cargar casi 40 µl a 20 µl de una muestra.
Ventajas:
Estos geles se pueden usar para determinar el pI o detectar cambios menores en una proteína debido a la desaminación, fosforilación o glicosilación. También pueden resolver diferentes proteínas de tamaño similar que no pueden resolverse en geles SDS-PAGE estándar [6] [7].
Referencia y lecturas sugeridas
- Geles Novex IEF | Thermo Fisher Scientific
- Bjellqvist, B., Ek, K., Righetti, PG, Gianazza, E., Görg, A., Westermeier, R. y Postel, W., 1982. Enfoque isoeléctrico en gradientes de pH inmovilizados: principio, metodología y algunas aplicaciones. Revista de métodos bioquímicos y biofísicos , 6 (4), pp.317-339.
- Righetti, PG, 2000. Enfoque isoeléctrico: teoría, metodología y aplicación (Vol. 11). Elsevier
- MATTHEW, M., HARRIS, AM, MARSHALL, MJ y Ross, GW, 1975. El uso del enfoque analítico isoeléctrico para la detección e identificación de β-lactamasas. Microbiología , 88 (1), pp.169-178.
- Enfoque isoeléctrico – Wikipedia
- La respuesta de Harsh Oza a ¿Cuáles son los usos del enfoque isoeléctrico?
Notas al pie
[1] Introducción al enfoque isoeléctrico
[2] Introducción al enfoque isoeléctrico
[3] Geles Novex IEF | Thermo Fisher Scientific
[4] Geles Novex IEF | Thermo Fisher Scientific
[5] Introducción al enfoque isoeléctrico
[6] Novex IEF Geles | Thermo Fisher Scientific
[7] La respuesta de Harsh Oza a ¿Cuáles son los usos del enfoque isoeléctrico?
