Este artículo describe el protocolo en general y de manera sucinta. Brevemente:
1. Seleccione un objetivo genómico y diseñe un ARN guía de 20 nt apropiado (sgRNA) utilizando un software como este para evaluar la especificidad.
2. Si tiene la intención de introducir una modificación de ADN específica en lugar de una indel aleatoria en el sitio objetivo, diseñe un oligonucleótido donante (ssODN) que represente la modificación deseada. El ssODN debe incluir brazos de homología de al menos 500 pb que flanqueen la región objetivo. Omita este paso si tiene la intención de eliminar simplemente el gen objetivo / secuencia reguladora en lugar de insertar una secuencia de ADN específica o introducir una mutación específica.
3. Seleccione y ejecute una estrategia de entrega . Uno puede ai) transfectar células objetivo con un plásmido que codifica tanto el sgRNA como el Cas9, a.ii) transfectar células objetivo con un plásmido que codifica el sgRNA y un plásmido separado que codifica Cas9, b) transfectar células objetivo con Cas9 mRNA y sgRNA , o c) transfectar el complejo Cas9-sgRNA final (RNP) preformado in vitro . Existe una variedad de estrategias de transfección, que incluyen a) electroporación / nucleofección, b) lipofección y otras. Determinar la estrategia de entrega óptima para sus celdas objetivo puede requerir un poco de prueba y error.
4. Si es posible, aislar las células transfectadas . Si usa la estrategia de transfección basada en plásmidos, puede aislar las células transfectadas al incluir un marcador de selección en el plásmido (como la fluorescencia, lo que le permite a uno usar FACS para seleccionar células transfectadas).
5. Si lo desea, determine si la edición de genes fue exitosa utilizando un ensayo SURVEYOR (si busca indeles) o secuenciando .
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