La ligadura de ADN es uno de los pasos más cruciales en el desarrollo del vector de ADN con el gen de interés. Para ligar el gen de interés al vector, utilizamos ADN ligasa y ligasa T4 . Sin embargo, en algunas condiciones, es posible que el gen de interés pueda tener extremos romos en lugar de extremos adhesivos después del tratamiento con las endonucleasas de restricción. La ligadura del fragmento del extremo romo del gen con el vector que tiene extremos adhesivos es difícil. En tal condición, usamos los enlazadores y adaptadores para generar los extremos adhesivos.
ADN enlazador [1] son oligonucleótidos bicatenarios cortos que tienen un sitio de restricción para generar los extremos adhesivos. Primero, agregamos el ADN conector al extremo romo mediante el uso de la enzima ligasa T4. La enzima ligasa T4 tiene la capacidad de unirse al ADN que tiene extremos romos formando enlaces fosfodiéster entre las cadenas. Una vez que se ha agregado el ADN conector a ambos extremos del gen de interés, tratamos el ADN con la endonucleasa de restricción para generar los extremos adhesivos. Sin embargo, si el gen de interés tiene un sitio de restricción, entonces el gen de interés también se escindiría.
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Para evitar tal situación, se utiliza una forma modificada de ADN conector, conocida como Adaptador de ADN [3]. El adaptador de ADN está hecho de tal manera que tiene un extremo pegajoso y el otro extremo es romo. Estos se agregan al extremo romo del gen de interés. Hay una limitación a esto también. La limitación a esto es que hay posibilidades de formación de extremos romos debido a la unión de los extremos adhesivos de los adaptadores. Para evitar esto, los adaptadores se tratan con la enzima llamada fosfatasa alcalina. Esta enzima elimina el grupo fosfato del extremo 5 ‘y lo reemplaza con el grupo OH. Sin el grupo fosfato, los extremos adhesivos no pueden ser ligados por la ADN ligasa a los extremos adhesivos existentes en el gen de interés. Por lo tanto, los extremos romos no se forman. Una vez que se forman los extremos adhesivos, el gen de interés se transfiere al vector. Antes de eso, se trata con la enzima llamada enzima polinucleótido quinasa para agregar un grupo fosfato al extremo 5 ‘.
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Referencia y lecturas adicionales:
- Brown, TA, 2016. Clonación génica y análisis de ADN: una introducción . John Wiley & Sons.
- Kang, CHULHO e Inouye, M., 1993. Inserción en un solo paso de conectores o adaptadores de oligonucleótidos al ADN usando oligonucleótidos no fosforilados. Biotechniques , 15 (4), pp.659-62.
- Wu, R., Wu, T. y Ray, A., 1987. [38] Adaptadores, conectores y metilación. Métodos en enzimología , 152 , pp.343-349.
- Hodges, E., Xuan, Z., Balija, V., Kramer, M., Molla, MN, Smith, SW, Middle, CM, Rodesch, MJ, Albert, TJ, Hannon, GJ y McCombie, WR, 2007. Captura de exón in situ de todo el genoma para la resecuenciación selectiva. Nature genetics , 39 (12), págs. 1522-1527.
- Zhang, YP y Rowhani, A., 2000. Una estrategia para la clonación rápida de ADNc a partir de plantillas de ARN bicatenario aisladas de plantas infectadas con virus de ARN utilizando Taq ADN polimerasa. Revista de métodos virológicos , 84 (1), pp.59-63.
- Enlazadores de oligonucleótidos
- Enlazadores: fosforamiditas y reactivos para la síntesis de oligonucleótidos (reactivos Proligo®) | Sigma-Aldrich
- Ligadura y transformación del ADN – Wiki
Notas al pie
[1] Ligación y transformación del ADN – Wiki
[2] Imagen en 50webs.org
[3] Adaptador (genética) – Wikipedia
[4] Imagen en discoverbiotech.com
