Las reacciones de PCR funcionan aumentando y disminuyendo la temperatura de los componentes durante varios ciclos para realizar algunas tareas diferentes.
- Desnaturalización : la temperatura se eleva por encima del punto de fusión del ADN y las dos cadenas complementarias de ADN se separarán.
- Recocido : la temperatura se reduce a aproximadamente 3-5 grados por debajo de la Tm de los cebadores, lo que hace que se emparejen con sus plantillas de ADN complementarias.
- Elongación : la temperatura se eleva lo suficiente como para que la ADN polimerasa pueda comenzar a agregar nuevos nucleótidos para emparejarse con la plantilla que comienza con el cebador pero no tan alta como para que el ADN se desnaturalice.
- Repita estos pasos muchas veces y duplicará aproximadamente la cantidad de ADN cada vez que repita.
Un problema importante para amplificar secuencias ricas en GC es que la temperatura de fusión es mucho más alta para guanina y citosina que para adenina y timina. Esto se debe a la mayor estabilidad de los tres enlaces de hidrógeno entre G y C en comparación con los dos entre A y T. Los cebadores de ADN que tienen un alto contenido de GC tienen más probabilidades de cebar a la secuencia de ADN incorrecta que le da el producto incorrecto porque sus Tm son un poco más altos que 3-5 grados por encima de la temperatura de recocido. Las regiones de ADN ricas en GC también pueden formar estructuras secundarias que interrumpen el alargamiento.
La Tm es el punto en el que la mitad de las moléculas de ADN se separarán en equilibrio y es una buena medida del tipo de rango de temperatura que necesita colocar debajo para que los cebadores se recojan. La Tm depende de la secuencia completa de los cebadores de ADN, así como de la concentración de sal. La energía libre entre una plantilla de ADN y un cebador coincidente con muchos Gs y Cs es mucho mayor que uno con más As y Ts y, por lo tanto, también tiene una Tm más alta. El propósito de la solución potenciadora es acercar la Tm de las regiones ricas en GC a las regiones AT para que los cebadores se recojan de manera rápida y uniforme.
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No pude encontrar el contenido exacto de las soluciones comerciales de potenciador de PCR, pero presumiblemente funcionan de manera similar a las soluciones académicas publicadas, como la adición de betaína . [1] Cuando la betaína se usa como un codisolvente, reduce la brecha entre la estabilidad de pares de bases AT y GC que es consecuencia de tener dos versos tres enlaces de hidrógeno. Esto acerca la Tm de las secuencias de ADN ricas en GC más cerca de la Tm de las secuencias ricas en AT. A continuación se muestran los perfiles de fusión de una secuencia de ADN rica en GC sin betaína (1) y con betaína 5.0M (2). Observe que la Tm se desplaza hacia abajo y es más nítida, lo que refleja un rango de fusión más estrecho de pares de bases GC y AT. /main-qimg-ad7fb3afac4660909d81a470b96afee0.png)
El efecto de la betaína sobre la fusión del ADN probablemente se deba a dos fuerzas termodinámicas competidoras.
- La betaína tiene un efecto desestabilizador independiente de la secuencia en todas las interacciones de emparejamiento de bases de ADN debido a su naturaleza cargada. Esto reduce la estabilidad de los enlaces de hidrógeno y disminuye la Tm de las regiones ricas en AT y GC en aproximadamente la misma cantidad. Solo con este efecto, las regiones ricas en GC tendrían aún mayores Tm en relación con las regiones ricas en AT.
- La betaína también se une preferentemente al surco principal de los sitios AT debido a un ligero efecto hidrofóbico entre el grupo metilo del surco principal de la betaína y la timina. Esto tiene un efecto estabilizador dependiente de la secuencia que aumenta la estabilidad del ADN de doble cadena en las regiones AT en relación con las regiones GC.
El resultado general de ambos efectos tomados en conjunto es que la estabilidad (y con ello la Tm) de las regiones ricas en AT de doble cadena disminuye, pero la estabilidad de las regiones ricas en GC se reduce aún más. La siguiente curva muestra la Tm de las cadenas de ADN frente a la fracción molar del contenido de GC. La curva superior (triángulos rellenos) es sin betaína y la curva inferior (círculos abiertos) es con la adición de betaína 5.6M. Tenga en cuenta que la Tm en presencia de betaína es aproximadamente independiente del contenido de GC , que era el objetivo original. /main-qimg-13594c825299148de5a2b47c37261060.png)
Otros codisolventes que funcionan como soluciones potenciadoras ricas en GC pueden funcionar de formas ligeramente diferentes, pero presumiblemente todos acercan la estabilidad de los pares de bases GC a los pares de bases AT, lo que hace que la Tm general sea menos dependiente del contenido de GC. Vale la pena señalar que hay otros trucos para ayudar a lidiar con el ADN rico en GC que quedan fuera del alcance de la pregunta. Al final, es difícil predecir los rendimientos de su PCR y jugar con las condiciones a través de prueba y error es la mejor manera de avanzar.
[1] WA Rees, TD Yager, J. Korte y PH von Hippel. La betaína puede eliminar la dependencia de la composición del par base de la fusión del ADN. Biochemistry 1993, 32, 137-144. doi: 10.1021 / bi00052a019 (http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1…)
[2] J. Marmur, P. Doty. Determinación de la composición base del ácido desoxirribonucleico a partir de su temperatura de desnaturalización térmica. Journal of Molecular Biology, 1962. 5, 109-118. 10.1016 / S0022-2836 (62) 80066-7.
(http://www.sciencedirect.com/sci…)
