¡Pero es mucho más fácil usar 32P! Estoy divagando.
La mejor etiqueta no radiactiva sería cualquier tinte fluorescente. La estrategia para obtener ese tinte en el extremo 5 ‘depende de si está tratando de etiquetar un ARN ya transcrito o sintetizando uno desde cero.
Si lo está sintetizando usando síntesis de ARN o IVT, debe obtener un nucleótido funcionalizado en 5 ‘. La mejor opción sería 5 ‘AmMC6 para usar la química del NHS Ester para acoplar su etiqueta fluorescente al extremo 5’. Alternativamente, un nucleótido modificado con tiol se puede acoplar a su etiqueta utilizando la química de maleimida.
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Si está utilizando una transcripción de ARN recientemente preparada, deberá ligar el nucleótido 5 ‘modificado al fragmento de ARN. Para eso, necesitará usar una férula para secuestrar los dos fragmentos de ARN y luego la ligadura enzimática con ADN ligasa o una ribozima. Este protocolo es de muy baja eficiencia, pero así es como se hacen los ARN modificados más grandes y los ARN con modificaciones internas.
Uno de los trucos clave para hacer que estos protocolos funcionen es eliminar completamente las aminas primarias competidoras que interferirán con la química del NHS. Por lo tanto, los componentes y péptidos Tris deben eliminarse mediante una etapa de purificación. Luego, deberá realizar otra ronda de purificación para aislar sus ARN etiquetados.
Sugiero echar un vistazo al etiquetado fluorescente de ARN sintéticos escritos por Max Greenfeld y Dan Herschlag. Si sabes algo sobre los dos, son bastante meticulosos y están orientados a los detalles.
