Cómo estimar el tamaño y la concentración de fragmentos de ADN.

1. ESTIMACIÓN DEL TAMAÑO DEL ADN

Tome el ADN de su interés y ejecútelo en gel de agarosa al 1%.

El ADN se moverá en el gel de acuerdo con su tamaño. Cuanto más grande es el tamaño del ADN, menos se aleja del pozo.

Junto con la muestra de ADN, cargue la escalera de ADN que sirve como marcador del peso molecular.

Al comparar nuestro ADN con el marcador, podemos encontrar el peso molecular de nuestro ADN de interés.

Fuente de la imagen: Aviso de redireccionamiento

2. ESTIMACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ADN

El ADN absorbe la luz con más fuerza a una longitud de onda de 260 nm.

Para medir la concentración de ADN, usamos la relación

Densidad óptica (OD) de 1 a 260 nm = 50 µg / ml de ADNds puro.

Tomamos 2 µl de ADN y medimos su absorbancia OD en el instrumento Nanovue.

Fuente de la imagen: Notifikasi Pengalihan

concentración de ADN = OD x factor de dilución x 50 µg / ml

Para estimar el tamaño de los fragmentos de ADN, generalmente hacemos electroforesis en gel de agarosa y si desea distinguir algunos fragmentos que predice que tienen un tamaño común, puede hacer electroforesis en gel de poliacrilamida. Ambos son polímeros y ambas técnicas usan la carga negativa del ADN para “ejecutar” los fragmentos aplicando un campo eléctrico en el gel de agarosa / poliacrilamida y los fragmentos de ADN están separados por tamaño en la matriz de gel de agarosa. Los fragmentos más grandes corren más lentamente y permanecen en la parte superior de la matriz, mientras que los fragmentos más pequeños corren más rápido y se mueven en la parte inferior. También ejecutamos fragmentos de ADN de tamaño conocido (marcador) para competir con la muestra Desconocida. Finalmente podemos ver los fragmentos de ADN a la luz ultravioleta.
Puede leer más sobre el método aquí: electroforesis en gel de agarosa
Es bastante simple y rápido, y se usa con mucha frecuencia en los laboratorios.

Para la concentración de muestras de ADN, puede hacer una estimación muy aproximada con el método anterior. Al conocer la concentración de marcadores y luego comparar la intensidad UV de los fragmentos marcadores con estas de las muestras.
También hay una máquina llamada “Nanodrop”, donde agrega aproximadamente 2 μl de ADN y le proporciona información sobre su concentración y otras cosas.
Finalmente, el método más preciso es la PCR cuantitativa (o PCR en tiempo real), donde puede monitorear en tiempo real la reacción de PCR, ya que ha agregado una molécula fluorescente que se une entre las bases de ADN.
Puede leer más sobre Q PCR aquí: reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real

La concentración de ADN se puede estimar mediante la técnica de electroforesis en gel, pero hoy en día la tecnología de nanodrop también ha aumentado la eficiencia de su estimación al mismo tiempo que el tamaño de los fragmentos de ADN también se puede estimar utilizando diferentes métodos de electroforesis en gel.