Incluya la secuencia de reconocimiento del sitio de restricción en la secuencia del cebador: generalmente (para la mayoría de los enfoques de clonación sencillos), el sitio de restricción se agrega cerca pero no en el extremo.
Por ejemplo, el sitio de reconocimiento EcoRI es GAATTC. Incluiría esto en la secuencia del cebador, de modo que el cebador lea 5 ‘GAATTC NNNNNNNNN, donde N es 18-20 nucleótidos correspondientes al gen o la región de ADN que quiero amplificar.
Pero como dije, el sitio de restricción se agrega cerca pero no al final. Esto se debe a que, en términos generales, la mayoría de las enzimas de restricción son menos eficientes para cortar su secuencia objetivo si está al final de un fragmento de ADN. Por lo general, queremos agregar 4–6 pares de bases en el extremo 5 ‘del cebador, entonces, para que el sitio de restricción no esté al final del producto de PCR que generaremos y digeriremos.
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Un recurso útil para planificar su diseño de cebador en estos casos es el cuadro NEB que brinda la eficiencia de la división de enzimas de restricción cerca de un fragmento de ADN: busque EcoRI: división cerca del final de los fragmentos de ADN y observe la cantidad de símbolos + en cada columna. (Más + símbolos = más actividad). En este caso, queremos agregar al menos 5 pares de bases, porque no vemos +++ hasta la columna más a la derecha (5 pb). La secuencia de estos pares de bases no importa, siempre que no sea otro sitio de restricción EcoRI (o sea reconocido por cualquier otra enzima de restricción que esté usando).
Su secuencia de cebador final, entonces, debe ser 5 ‘(5N) GAATTC (20N), donde los primeros 5N son bases aleatorias y el 20N final corresponde a la secuencia que desea amplificar.
Una vez que haya diseñado sus imprimaciones, es posible que desee verificar sus propiedades utilizando algo como IDT Oligo Analyzer Tool: http://www.idtdna.com/calc/analyzer que le permite verificar posibles problemas como horquillas y dímeros automáticos. . Si está diseñando dos cebadores que usarán juntos, puede verificar que no formen heterodímeros y que sus valores de temperatura de fusión (Tm) estén dentro del mismo rango. (Este paso de verificación final es un poco opcional, para ser sincero, para la PCR de rutina, a menudo lo omito, pero puede ser útil para cebadores complicados)
Otro buen recurso es In Silico PCR: amplificación In silico PCR que puede utilizar cuando haya diseñado sus cebadores para PCR. Seleccione su genoma de interés o proporcione la secuencia que está utilizando si no está en su base de datos e ingrese sus secuencias de cebadores. (Simplemente ingrese la secuencia 20N: los sitios de restricción obviamente no estarán presentes en la secuencia de ADN genómico). Esta es una buena manera de verificar que sus cebadores realmente amplifiquen la secuencia que desea.
¡Buena suerte!
