La característica más importante para que Cas9 pueda unirse al ADN objetivo es algo llamado motivo adyacente protoespaciador, o PAM. Si la secuencia a la que apunta con un ARN guía no está inmediatamente aguas arriba de un PAM, Cas9 nunca será capaz de cortar el ADN.
Se requiere el PAM para desenrollar y fundir (es decir, separar en dos cadenas individuales) el ADN aguas arriba, lo que otorga acceso al complejo de ARN de guía Cas9. S. pyogenes Cas9, el Cas9 utilizado para la mayoría de las aplicaciones de edición, reconoce un PAM de NGG, donde N es cualquier base. El PAM es reconocido por aminoácidos específicos, que se encuentran cerca de otro conjunto de aminoácidos que atrae la cadena principal del ADN hacia Cas9 (y, por lo tanto, hacia el ARN).
En S. pyogenes Cas9, se cree que esto requiere cuatro aminoácidos específicos: la arginina 1333 y la arginina 1335 reconocen específicamente el GG de la PAM; la lisina 1107 se intercala entre las dos citosinas en la cadena opuesta a la PAM, y la serina 1109 (junto con algunos átomos de la cadena principal) “retiene” el fosfato de la primera base aguas abajo del CC. Este es el paso crítico: esencialmente “bloquea” el fosfato en una posición que promueve el emparejamiento de bases con el ARN guía, que comienza el desplazamiento de la cadena y la eventual formación de híbridos de gRNA / ADN.
- ¿Qué piensa sobre el artículo 'Un modelo computacional de célula completa predice el fenotipo a partir del genotipo' (Karr et al. 2012)?
- ¿Cuál es el estado del arte en el modelado de redes reguladoras de genes?
- ¿Qué es la técnica de transferencia Southern?
- ¿Cuál es el papel del magnesio en la digestión de restricción?
- ¿Qué es la variabilidad de nucleótidos?
De: Página en nature.com
