¿Cuál es la función de notocorda en los cordados? La Ciencia y la Tecnología mejoran el futuro

Roles del notocordio en el desarrollo de vertebrados

Patrones

El notocordio tiene varios roles bien establecidos en el diseño de los tejidos circundantes. Como estos temas se han revisado exhaustivamente en otros lugares (Cleaver y Krieg, 2001; Dodd et al., 1998; Hogan y Bautch, 2004; Holland et al., 2004), solo menciono algunos de los roles principales aquí. Quizás el mejor caracterizado es el papel del notocordio en el diseño del tubo neural. Una serie de experimentos que involucraron tanto el trasplante como la eliminación de la notocorda durante el desarrollo mostraron que la notocorda puede indicar la formación de la placa del piso, que es el destino más ventral de la médula espinal (Placzek et al., 1991; van Straaten et al., 1989; Yamada et al., 1991). Entre las señales secretadas por el notocordio se encuentran las proteínas Hedgehog (Hh). Sonic Hedgehog, en particular, induce una variedad de destinos de la médula espinal ventral de manera gradual, mientras que al mismo tiempo suprime la expresión de genes característicamente dorsales (Placzek et al., 1993; Yamada et al., 1993; Yamada et al., 1991). Reforzando y manteniendo eventos de desarrollo anteriores, las señales de notocorda también están involucradas en el establecimiento de la asimetría LR; La ablación del notocordio en Xenopus gastrulae resulta en la aleatorización de la asimetría (Danos y Yost, 1995; Lohr et al., 1997). En los teleósteos, las señales Hh derivadas de notocorda controlan la formación del miosepto horizontal, además de especificar destinos musculares de contracción lenta (Barresi et al., 2000; Devoto et al., 1996). Las señales derivadas de Notochord son importantes para especificar la formación de la aorta dorsal (Cleaver et al., 2000; Fekany et al., 1999; Isogai et al., 2003; Lawson et al., 2002), así como para la especificación normal del campo cardíaco (Goldstein y Fishman, 1998). Finalmente, la notocorda es importante para el desarrollo normal del endodermo temprano y el páncreas (Cleaver y Krieg, 2001; Kim et al., 1997).

Estructural

Aunque los roles de diseño del notocordio son esenciales para el desarrollo normal de los vertebrados, el notocordio también tiene un papel estructural esencial. La notocorda es el elemento esquelético axial principal del embrión temprano del cordado; sin un notocordio completamente diferenciado, los embriones no se alargan (Odenthal et al., 1996; Saúde et al., 2000; Schulte-Merker et al., 1992; Schulte-Merker et al., 1994; Stemple et al., 1996; Talbot et al., 1995). Para muchas especies, esto resulta en la incapacidad de nadar adecuadamente, escapar de la depredación y alimentarse. Parte de la comprensión de esta función del notocordio se ha derivado de estudios de mutaciones del pez cebra (Driever et al., 1996; Haffter et al., 1996). Se identificaron varios loci involucrados en la formación de notocorda en varias pantallas sistemáticas a gran escala para las mutaciones que afectan la embriogénesis del pez cebra (Fig. 3) (Odenthal et al., 1996; Stemple et al., 1996). Como he comentado, algunos de los loci identificados en estas pantallas han resultado ser importantes para la formación del acordesodermo, destacando importantes funciones de señalización del notocordio. Sin embargo, se ha encontrado que la mayoría de los loci son profundamente importantes para los aspectos estructurales de la función notocorda.

Para comprender la estructura de la notocorda, es útil considerar la notocorda como parte de un sistema mecánico requerido para la locomoción (Fig. 4). Los embriones de pez cebra, por ejemplo, pueden voltear sus colas dentro de 1 día de la fertilización, y eclosionar y nadar dentro de 3 días. Por analogía, la notocorda es como una manguera contra incendios, que posee una vaina fuerte pero flexible que puede resistir altas presiones hidrostáticas. Considere entonces una situación en la que la manguera de bomberos se llena con globos de agua, cada uno empujando contra el otro y contra la vaina. En tal disposición, la manguera contra incendios sería alargada y rígida, pero capaz de doblarse en cualquier dirección. Finalmente, con los cables que corren a lo largo de la parte superior e inferior de la manguera de incendio inflada, los cables resistirían cualquier flexión hacia arriba o hacia abajo de la manguera, y cualquier fuerza que actúe sobre la manguera de incendio la desviaría lateralmente. Para el embrión de pez cebra, el equivalente de la manguera de bomberos es la membrana basal perinocordal y los globos de agua son las células notocordadas al vacío. A lo largo de la parte superior de la notocorda se encuentra la placa del piso y en la parte inferior se encuentra la hipocordía. De acuerdo con este papel estructural, tanto la placa del piso como el hipocordio expresan una variedad de proteínas del cartílago, como el colágeno tipo II (Yan et al., 1995). Además, las mutaciones en genes como oep y cyclops ( ndr2 – Zebrafish Information Network), que conducen a una pérdida sustancial de la placa del piso, también producen embriones con una profunda curvatura hacia abajo (Hatta, 1992; Hatta et al., 1991; Schier et al. al., 1997). Por lo tanto, aunque todavía no se ha establecido directamente, es posible que la placa del piso y el hipocordio actúen como cables en los respectivos lados dorsal y ventral de la notocorda.

En el pez cebra, la formación de la membrana basal perinocordal y la vacuola se ven afectadas por dos clases de mutaciones fenotípicas. Una clase, originalmente encontrada para afectar tanto el desarrollo del notocordio como el del cerebro, comprende los loci tímidos, gruñones y somnolientos . Recientemente se ha encontrado que estos loci codifican el pez cebra laminina α1 ( tímida ), lamininaβ 1 ( gruñona ) y laminina γ1 ( somnolienta ), que son componentes de la membrana basal (Parsons et al., 2002) (SM Pollard, tesis doctoral, Universidad College London, 2002). Originalmente se descubrió que la segunda clase de mutaciones afecta el desarrollo de notocorda y melanóforo temprano en la embriogénesis, lo que eventualmente conduce a la muerte celular catastrófica en embriones mutantes. Esta clase comprende estornudos, feliz y tonto , que codifican, respectivamente, las cadenas α, β y γ del complejo de revestimiento, que es un componente importante de la vía secretora y es esencial para la supervivencia de todas las células eucariotas (Coutinho et al., 2004). Normalmente se consideraría que el complejo de coatómeros realiza una función de limpieza eucariota. Es sorprendente que la pérdida de la actividad del coatómero en los embriones de pez cebra conduciría a un fenotipo de notocorda. Una explicación es que el coatómero se suministra por vía materna, y que la notocorda en formación se encuentra entre los primeros tejidos en los que la demanda secretora excede el suministro materno. Esta pérdida de actividad secretora conduce a la pérdida de la membrana basal de notocorda y a un fallo en la formación de vacuola. Juntos, los mutantes de pez cebra laminina y coatomero destacan la importancia de la estructura de notocorda para su función.

Estructura de lamininas y notocorda

Las lamininas son complejos de proteínas heterotriméricas obligatorias que consisten en una cadena α, β y γ, y son parte integral de las membranas basales. La membrana basal son estructuras ubicuas con diversas funciones, pero generalmente están asociadas con un epitelio. Típicamente en una membrana basal, los trímeros de laminina se polimerizan para formar una malla, que está reticulada a una malla de colágeno tipo IV por nidogenos (Colognato y Yurchenco, 2000; Iozzo, 1998; Timpl y Brown, 1996; Yurchenco y O’Rear, 1994) . Además, asociados con las membranas basales están los proteoglicanos de heparina-sulfato (Iozzo, 1998). Las membranas basales son importantes para definir los límites entre los tejidos, para la señalización entre las células y, en algunas situaciones, para proporcionar una fuerte barrera mecánica (Timpl y Brown, 1996). El último papel es de particular importancia en el glomérulo renal, donde la membrana basal sirve como parte integral del aparato de filtración mientras soporta altas presiones hidrostáticas (Miner y Li, 2000). Esto es similar al papel que desempeña la membrana basal perinocordal.

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Fig. 3.

Etapas del desarrollo de notocorda afectadas por mutaciones. La transición del organizador dorsal al acordesosodermo se ve afectada por mutaciones en varios genes. En la parte superior de la cascada de especificaciones dorsales se encuentran las proteínas ichabod y β -catenina (Kelly et al., 2000). En su ausencia, se pueden formar tipos ventrales de mesodermo, pero no cordomesodermo. El bozozok y los loci de la cabeza flotante codifican cada uno proteínas que contienen homeodominio que son necesarias para la especificación de corordamesoderm. En ausencia total de oep , como en el mutante materno-cigótico (Mz), no se especifica el mesendodermo, incluido el chordamesoderm. Las lamininas ( tímidas, malhumoradas y con sueño ), los coatómeros ( estornudos, felices y tontos ), brachyury ( sin cola ) y un locus desconocido, doc , son necesarios para una adecuada diferenciación de notocorda. Las puntas de flecha indican (A) la región progenitora del acorde de los cuerdos del escudo, (B) el acorde de los cuerdos y la notocorda diferenciada.

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Fig.4.

Aspectos estructurales de la notocorda. (A) Una vista lateral de una cola de pez cebra viva a 24 hpf, que muestra las características principales del notocordio. Dorsal a la notocorda se encuentra la placa del piso, en la parte más ventral de la médula espinal en formación. Ventral a la notocorda es la hipocordia. (B) Un diagrama esquemático de las secciones laterales y transversales de la notocorda, que muestra la placa del piso y la hipocordía actuando como cables que corren a lo largo de la parte superior e inferior de la notocorda. (C) Además de la notocorda, la placa del piso y el hipocordio expresan colágeno tipo II (Yan et al., 1995). cc, canal central; fp, placa de piso; hy hipocordio; no, notocordio; nt, tubo neural.

Las lamininas son diversas y probablemente reflejan sus diversos roles. En los humanos hay cinco genes codificadores de laminina α, cuatro β y tres γ. Mediante diversas combinaciones de cadenas α, β y γ, se han identificado hasta 12 isoformas de laminina diferentes (Colognato y Yurchenco, 2000). En el pez cebra, hasta ahora, la mayoría de los genes de laminina se pueden encontrar en la secuencia genómica, aunque solo unos pocos se han secuenciado como ADNc de longitud completa.

La clonación posicional de los loci tímidos, gruñones y somnolientos del pez cebra condujo a la identificación de tres cadenas de laminina; α 1, β1 y γ1 (Parsons et al., 2002) (SM Pollard, tesis doctoral, University College London, 2002). Los fenotipos mutantes de gruñón y somnoliento son indistinguibles, mientras que el fenotipo tímido siempre es más débil. Durante el desarrollo de embriones mutantes gruñones y somnolientos , el fenotipo notocorda se hace evidente por primera vez cuando las vacuolas no se forman correctamente y cuando los genes que se expresan característicamente por chordamesoderm, como echidna hedgehog , no se extinguen, como lo harían durante la diferenciación normal de notocorda. El análisis microscópico electrónico de la membrana basal perinocordal muestra que está completamente ausente en estos mutantes, y la tinción de anticuerpos muestra una falta completa de inmunorreactividad de laminina 1 en los embriones mutantes gruñones y somnolientos más gravemente afectados. En los embriones mutantes tímidos más débiles, la membrana basal perinocordal solo falta en las regiones anteriores afectadas de la notocorda. En la parte posterior de estos embriones, la notocorda normalmente se diferencia y tiene inmunorreactividad con laminina 1. Las diferencias entre tímido y gruñón o somnoliento se deben a una redundancia entre las cadenas α de laminina. La interrupción de la expresión de laminina \ alpha 4 en embriones mutantes tímidos , que carecen de laminina \ alpha 1, conduce al fenotipo notocorda grave observado en mutantes gruñones y somnolientos , y una pérdida completa de la inmunoreactividad de laminina 1 (SM Pollard, tesis doctoral, University College London, 2002).

Estas cuatro cadenas de laminina – α1, α4, β1 y γ1– participan en la formación de la membrana basal perinocordal, y el corordamesoderm expresa ARNm para cada cadena. Pero, ¿la notocorda sola representa la laminina en su membrana basal? Esta pregunta ha sido abordada por un ensayo de injerto organizador. En estos experimentos, se injertó un organizador dorsal de tipo salvaje en la región ventral de un embrión mutante huésped, o viceversa, y se analizó la diferenciación morfológica de los embriones gemelos resultantes. Sorprendentemente, tanto para los tejidos mutantes gruñones como somnolientos , ambos tipos de injertos condujeron al mismo resultado, un notocordio normalmente diferenciado (Parsons et al., 2002). Un análisis de la inmunorreactividad de la laminina mostró que cuando el organizador de tipo salvaje se trasplanta en huéspedes mutantes, las proteínas de la laminina 1 rodean el notocordio trasplantado. Por lo tanto, las lamininas pueden ser suministradas por fuentes notocordales adicionales o por la propia notocorda.

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Fig.5.

Membrana basal pericorodal. (A) La estructura trilaminar de la membrana basal perinocordal (entre las puntas de flecha) mostrada mediante microscopía electrónica, desde la vaina de una célula de notocorda de tipo salvaje. i, capa interna; m, capa medial; o, capa exterior. (B) Esta estructura se rompe en la vaina de una célula notocorda mutante tonta, donde faltan las capas externa y medial. Es probable que la capa interna consista en laminina, ya que los niveles (C) de inmunorreactividad de laminina de tipo salvaje se ven claramente en (D) embriones mutantes estornudos , pero se eliminan en (E) mutantes somnolientos .

Existe alguna relación entre la diferenciación de notocorda y la presencia de la membrana basal. Es probable que esto implique la señalización desde la membrana basal hasta el acordesodermo. El estado de diferenciación puede determinarse mediante el análisis de la expresión génica. Por ejemplo, echidna hedgehog , que es un homólogo de pez cebra del mamífero erizo indio, normalmente se expresa en chordamesoderm, pero cuando el notocordio se diferencia y las vacuolas se inflan, la expresión de echidna hedgehog se extingue (Currie e Ingham, 1996). Sin embargo, en los mutantes, echidna hedgehog se expresa de forma persistente (Parsons et al., 2002). Por el contrario, cuando el notocordio mutante se desarrolla en un fondo de tipo salvaje, el notocordio se diferencia normalmente, lo que sugiere que se recibe una señal que reside en la membrana basal. Una posibilidad es que la laminina en sí sea la señal. Hay muchos receptores de laminina en la superficie celular, pero la interrupción de varios de estos receptores no puede copiar el fenotipo de pérdida de función de la laminina, aunque otros fenotipos son evidentes. Otra posibilidad es que otra señal que reside en la membrana basal sirva como una señal de diferenciación de notocorda. La presencia de proteoglicanos de heparina-sulfato en las membranas basales en general, y específicamente en las membranas basales de notocorda, proporcionaría el contexto correcto para una variedad de proteínas de factor de crecimiento soluble. La naturaleza de la señal de diferenciación de notocorda, sin embargo, queda por resolver.

Estos estudios muestran que la formación de una membrana basal pericorodal es esencial no solo para la estructura del notocordio, sino también para la diferenciación adecuada del notocordio. De hecho, la pérdida de varios otros genes que no son componentes de la membrana basal, per se, pero que afectan la formación de la membrana basal pericorodal, también afecta la diferenciación del notocordio.

Coatomers y estructura notocorda

Al igual que los mutantes laminina somnolientos y gruñones , los mutantes estornudos, felices y tontos también son fenotípicamente indistinguibles (Coutinho et al., 2004). En estos mutantes, el notocorda no logra diferenciarse, medido tanto por la expresión persistente de genes marcadores tempranos, como el equidna hedgehog , como por la incapacidad de formar vacuolas normalmente infladas. Como en los mutantes de laminina, la membrana basal no se forma correctamente. Sin embargo, a diferencia de los mutantes de laminina, comenzando aproximadamente 48 horas después de la fertilización estornuda, los mutantes felices y tontos sufren una muerte celular generalizada por apoptosis y los embriones se desintegran. Mediante la clonación posicional, identificamos que estornudos, felices y tontos codifican las proteínas de los revestimientos α, β y β ‘del pez cebra (Coutinho et al., 2004).

Siete subunidades de coatómeros, en combinación con la pequeña GTPasa Arf1, forman el revestimiento de vesículas COPI (Bannykh et al., 1998; Cosson y Letourneur, 1997; Lowe y Kreis, 1998; Nickel y Wieland, 1998). En las células eucariotas, existen al menos tres sistemas de recubrimiento vesicular. Las vesículas recubiertas de clatrina manejan la endocitosis y las vesículas recubiertas con COPII median el transporte de carga secretora desde el retículo endoplásmico al Golgi. Se cree que las vesículas recubiertas con COPI son en gran parte responsables del transporte retrógrado de enzimas dentro del Golgi que mantienen su polaridad, y de la maquinaria que transporta las proteínas desde el Golgi de regreso al retículo endoplásmico rugoso (RER).

El análisis microscópico electrónico reveló dos características importantes de las células notocorda en mutantes de coatómero de pez cebra (Coutinho et al., 2004). Primero, la vía secretora está bloqueada, lo que resulta en acumulaciones masivas de materiales dentro del RER, y es evidente la interrupción del aparato de Golgi. En segundo lugar, la membrana basal perinocordal no se forma. Normalmente, la membrana basal perinocordal tiene una estructura trilaminar (Fig. 5). La capa más cercana a la membrana plasmática es un material único, oscuro y con aparentes reticulaciones a la membrana plasmática subyacente. Distal a esta capa hay una capa medial de fibras orientada en una dirección alrededor de la célula notocorda, y distal a esta es una capa externa de fibras orientada en una dirección ortogonal. En los mutantes del coatómero, las dos capas externas no están presentes, pero a menudo se observa una capa interna distinta. La tinción con anticuerpo laminina 1 sugiere que la capa interna comprende en gran medida la laminina. Usando injertos organizadores dorsales de tejido mutante en embriones de tipo salvaje, y viceversa, se investigó el origen embrionario de las dos capas externas de esta membrana basal. Aunque experimentos similares de injerto con mutantes de laminina mostraron que la laminina podría ser suministrada por la propia notocorda o por fuentes extranotocordal, los injertos de tejido mutante de coatómero muestran que tanto el RER como el fenotipo de la membrana basal son autónomos de la notocorda. Por lo tanto, mientras que la capa interna rica en laminina puede ser suministrada por los tejidos circundantes, es probable que las capas externas de la membrana basal perinocordal sean secretadas por las propias células notocorda.

El notocordio tiene dos características, una membrana basal gruesa y una vacuola, que presentan una demanda inusual en la vía secretora. Las proteínas de coatómero son esenciales para todas las células y tanto los ARNm de proteínas como los de coatómeros se suministran por vía materna. Durante el desarrollo de tipo salvaje, los ARNm que codifican las proteínas de los revestidores se expresan en chordamesoderm a un alto nivel. De hecho, cuando se observa por hibridación in situ, la expresión de mRNA de coatómero parece ser específica de los acordes y tiene un patrón de expresión temporal y espacial similar a genes como flh . Es probable que el alto nivel de expresión de coatómeros en el desarrollo del corordamesoderm sea cigótico y, por lo tanto, proporcione alguna explicación de cómo las mutaciones en un gen esencial de la célula podrían conducir a defectos de desarrollo tempranos específicos.

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