La selección azul-blanca es la técnica utilizada para determinar si el huésped (bacterias) que se transforma tiene el plásmido (vector) con el gen de interés o no, es decir, para distinguir entre los transformantes que tienen un vector recombinante y no recombinante.
Cuando los vectores se cortan mediante la endonucleasa de restricción y se agregan a los fragmentos del gen de interés escindido con la misma endonucleasa de restricción; Tiene dos posibilidades diferentes. En un caso, es posible que el gen de interés se una con el vector en presencia de la ADN ligasa. La otra posibilidad es que los extremos escindidos del vector puedan volver a unirse en presencia de la ADN ligasa sin la incorporación del gen de interés. Utilizamos esta técnica para determinar si la célula bacteriana tiene el gen de interés o no.
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Imagen [1]
Concepto basico
El sistema bacteriano tiene un operón Lac que codifica las proteínas necesarias para el metabolismo de la lactosa. LacZ produce una enzima beta-galactosidasa que existe como homotetramer. Sin embargo, una β-galactosidasa mutante derivada de la cepa M15 de E. coli tiene sus residuos N-terminales 11-41 eliminados y este mutante, el péptido ω, no puede formar un tetrámero y está inactivo. Sorprendentemente, si se incorpora el péptido LacZα restante, el LacZ estaría completo y formaría un homotetramer activo. Este fenómeno se llama α-complementación.
La beta-galactosidasa no solo metaboliza la lactosa sino que también reacciona con otros componentes. X-Gal que se utiliza en la selección azul-blanco es un componente incoloro. Cuando la Beta-Galactosidasa está presente, reaccionaría con la X-Gal y la escindiría para formar 5-bromo-4-cloro-indoxilo. 5-bromo-4-cloro-indoxilo se dimerizará para formar un pigmento insoluble azul brillante 5,5′-dibromo-4,4′-dicloro-índigo [1].
Imagen [2]
En el experimento, las E. coli utilizadas son mutantes que tendrían la secuencia para el péptido and y no el LacZα. El vector elegido tendría el gen para LacZα. El LacZα tiene sitios internos de clonación múltiple. Si el gen se ha incorporado dentro del vector, entre el LacZα, entonces la transcripción del LacZα no ocurriría. Por lo tanto, la Beta-galactosidasa no se formaría en la célula, y la X-Gal no se convertiría en un componente azul brillante. Las colonias blancas significarían la presencia de células transformantes.
Por el contrario, si el vector se ha resellado sin el gen en presencia de ADN ligasa después de la escisión por la enzima de restricción, el LacZα no se vería afectado. Por lo tanto, LacZα sería transcrito, y la célula produciría Beta-Galactosidasa activa. Por lo tanto, las colonias de los no transformantes aparecerían como azules.
Los vectores pUC8 tienen LacZα (LacZ ‘) con múltiples sitios de restricción. Por lo tanto, la selección azul blanco es el método utilizado para distinguir entre las células recombinantes y no recombinantes.
Nota: Si la información es irrelevante, proporcione su sugerencia y correcciones a la respuesta anterior.
Referencia y lecturas sugeridas:
- Julin, D., 2014. Selección azul-blanca. En Molecular Life Sciences (pp. 1-2). Springer Nueva York.
- Pantalla azul-blanca – Wikipedia
- Brown, TA, 2016. Clonación génica y análisis de ADN: una introducción . John Wiley & Sons.
- Pommerville, JC, 2004. Fundamentos de la microbiología de Alcamo . Jones y Bartlett Learning.
- Tortora, GJ, Funke, BR, Case, CL y Johnson, TR, 2004. Microbiología: una introducción (Vol. 9). San Francisco, CA: Benjamin Cummings.
- Willey, JMS, Woolverton, L., Willey, CJJM, Sherwood, LM y Woolverton, CJ, 2009. Prescott, Harley y Klein, microbiología (No. Sirsi) i9788448168278).
- Angelastro, JM, Ryu, EJ, Törõcsik, B., Fiske, BK y Greene, LA, 2002. El paso de selección azul-blanco mejora el rendimiento de los concatemers SAGE. Biotechniques , 32 (3), págs. 484-486.
- Lerner, CG e Inouye, M., 1990. Plásmidos de bajo número de copias para la expresión regulada de bajo nivel de genes clonados en Escherichia coli con capacidad de detección de inserto azul / blanco. Investigación de ácidos nucleicos , 18 (15), p.4631.
Notas al pie
[1] Imagen en wikimedia.org
[2] Selección azul-blanco
