Bueno, se hace cada vez más fácil simplemente secuenciar ambos genomas y extraer el marcador de interés. 🙂
En serio, la forma estándar de hacer esto es secuenciar amplicones a partir de cebadores de PCR degenerados. Este es uno de los muchos significados de “código de barras de ADN”.
Primero, elige el tamaño de tu amplicón. Para Illumina o Ion Torrent, esto significaría mantenerlo en el rango de tamaño que funciona bien en esas plataformas en el modo que está utilizando. Además, es posible que desee mantener un rango para Illumina para que las dos lecturas se superpongan en el medio. Para Sanger, PacBio de Oxford Nanopore, en realidad son solo los límites de la PCR, aunque si desea dos lecturas de Sanger, es una buena idea permanecer por debajo de 2 veces la longitud de lectura que espera.
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Para los ARN estructurales conservados, como el ARN ribosómico, hay una serie de conjuntos de cebadores en la literatura, pero a través del ejercicio de diseñar el suyo propio, alinearía los ADN de interés e intentaría encontrar dos regiones que estén bien separadas. perfectamente conservado donde diseñas cebadores y tienes suficiente diversidad entre ellos. Si es necesario, encuentre algunas posiciones que no estén conservadas y ordene una mezcla de nucleótidos degenerada para esa posición o use inosina en el cebador (se combina bastante bien con todo). Pero querrá calcular la degeneración general del cebador; demasiadas posiciones mixtas y no habrá mucha secuencia individual en la mezcla.
Para los marcadores de proteínas, un enfoque es alinear todas las secuencias de proteínas, luego encontrar una región que se conserve lo suficiente y use aminoácidos con pocos codones que den buenos amplicones con baja degeneración, por lo que evitará particularmente Leu, Ser y Arg ya que tener 6 codones cada uno. Si está interesado en un conjunto taxonómico muy restringido, puede considerar alinear las secuencias de nucleótidos ya que las opciones de codones pueden estar restringidas por el sesgo de codones o la historia evolutiva.
Poner una secuencia de “abrazadera” de 5 ‘rica en G + C puede ser muy útil para la PCR degenerada: es un motor cinético en las rondas posteriores para conducir a los miembros del grupo de cebadores restantes que coinciden mal para cebar las hebras producidas por rondas anteriores. CODEHOP es un esquema particular para diseñar las abrazaderas que vale la pena mirar.
En todos estos casos, las secuencias de sus amplicones que corresponden a los cebadores deben recortarse antes del análisis, solo son conducidas por los cebadores. Además, para genes altamente conservados, como el ARNr, puede haber problemas con la formación de quimeras a través de productos de extensión incompletos que se ceban entre sí.
También existen esquemas para la captura de hibridación o PCR de un solo lado para extraer genes conservados para la secuenciación en plataformas de alto rendimiento (es decir, no Sanger). Si puede encontrar un solo sitio lo suficientemente largo, el menú desplegable Cas9 muerto también podría ser una opción.
¡Buena suerte!
