¿Por qué un cebador se une a una cadena de ADN y los ácidos nucleicos solitarios no?

Los ácidos nucleicos forman diferentes formas en una solución química. Los factores que influyen en esto incluyen las secuencias de bases mismas, la concentración de sales, el pH y la temperatura. Las interacciones que tienen lugar en una población mixta de ácidos nucleicos (diferentes secuencias y longitudes) se verían aleatorias y caóticas si pudiéramos visualizarlas en tiempo real.

Lo pequeño es fuerte . Se diseñó un cebador de ~ 20 pares de bases para tener una complementariedad perfecta con una secuencia objetivo (mucho más grande que sí misma). Con suerte, se diseñó para minimizar la estructura secundaria, la tendencia a la unión automática (por ejemplo, una molécula que crea un bucle en sí misma o dos moléculas idénticas que se juntan de la cabeza a la cola). La complementariedad de secuencia permite patrones específicos de enlace de hidrógeno entre las bases nitrogenadas (A: T = 2; G: C = 3). Cuantos más enlaces secuenciales, más “fuerte” es el apego.

Grande es débil . Una vez que las hebras de ADN se han separado en solución por alto calor (~ 95 grados centígrados) y lentamente comienzan a enfriarse, pueden formarse uniones transitorias (o recocido) entre fragmentos más grandes de ADN monocatenario que no son completamente complementarios. Pero las regiones que no coinciden se irán derrumbando como los hombres que usan muchas empresas para la comercialización al aire libre. Los dúplex de ADN que caen se romperán más fácilmente cuando la temperatura se eleva o estéricamente dificultan la accesibilidad de una ADN polimerasa.

La clave aquí es el número y tipo de emparejamientos de bases. Los soportes de ADN complementarios se mantienen unidos por muchos enlaces de hidrógeno muy débiles. Cuando digo “débil” me refiero a aproximadamente 100 veces más débil que los enlaces covalentes típicos en las biomoléculas.

Por lo tanto, cuando en la PCR calienta su ADN a su “temperatura de fusión”, lo que está haciendo es agregar suficiente energía cinética al sistema para romper estos enlaces H entre pares de bases, pero no los covalentes que mantienen unidos a los otros átomos. En cualquier caso, los átomos se agitan rápidamente en solución. Este video muestra esta actividad un poco.

Una vez que se derrite el ADN, es muy probable que muchos dNTP libres solos (nucleótidos trifosfatos) encuentren sus combinaciones perfectas a lo largo del ssDNA, pero debido a la energía del sistema, se unen y se separan muy rápidamente, y nunca forman una estructura estable. . Y dado que es probable que no estén flanqueados por otros dNTP solitarios que también se conectaron brevemente con sus compañeros, y luego se alejaron flotando, la ADN polimerasa no puede conectarlos a través del enlace fosfodiéster (covalente) de la columna vertebral de fosfato.

Por el contrario, con un cebador de ~ 20 NT, a medida que la solución se enfría, con sus enlaces de ~ 50 H, es lo suficientemente estable como para unirse lo suficiente como para que el complejo de ADN polimerasa comience a hacer su trabajo y continúe agregando el dNTP apropiado a la cadena existente.