- Pon el etanol al 95% en el congelador para enfriarlo. Utilizará esto más adelante, en el paso 12.
- Prepare dos baños de agua, uno a 55-60 ° C y otro lleno de cubitos de hielo y agua, alrededor de 4 ° C. Para el baño de agua caliente, se puede usar una olla de metal grande junto con un termómetro con un rango de temperatura apropiado. Para el baño de hielo, un tazón para mezclar lleno de hielo y agua funciona bien.
- En el vaso de precipitados de 250 ml (o una taza medidora de 1 taza), prepare una solución que contenga 10 mililitros (ml) (1 cucharada [cucharada]) de detergente líquido para lavar platos o champú y una cucharadita de 1/4 de taza (1,5 gramos) de sal de mesa.
- Agregue agua destilada al vaso de precipitados para obtener un volumen final de 100 ml. Disuelva la sal revolviendo lentamente para evitar la formación de espuma.
- Pique en trozos grandes una cebolla grande con un procesador de alimentos o una licuadora (se puede hacer a mano si no hay ninguno disponible) y póngala en un vaso de precipitados de 1000 ml (o una taza medidora de 4 tazas). Para mejores resultados, no pique la cebolla muy finamente. El tamaño de las piezas debe ser como las que se usan para hacer espaguetis. Es mejor tener las piezas demasiado grandes que demasiado pequeñas.
- Cubra la cebolla picada con los 100 ml de solución del paso 4. El detergente líquido hace que la membrana celular se rompa y disuelve los lípidos y proteínas de la célula al romper los enlaces que mantienen la membrana celular unida. El detergente hace que los lípidos y las proteínas precipiten fuera de la solución. La sal de mesa (NaCl) permite que los ácidos nucleicos precipiten de una solución de etanol porque protege el extremo negativo de fosfato del ADN, haciendo que las cadenas de ADN se unan y se unan.
- Coloque el vaso de precipitados de 1000 ml con la cebolla picada y la solución en un baño de agua caliente a 55-60 ° C, como se muestra en la Figura 1, a continuación, durante 10-12 minutos. Si está utilizando una olla de metal grande para un baño de agua, retire la olla de la estufa antes de colocar el vaso en el interior; el procedimiento es más seguro si la olla está fuera del quemador. Continúe controlando la temperatura del baño de agua y realice los ajustes necesarios (es decir, agregue agua fría o caliente). Durante este tiempo, también presione la mezcla de cebolla picada contra el costado del vaso con la parte posterior de la cucharada. No mantenga la mezcla en el baño de agua caliente durante más de 15 minutos porque el ADN comenzará a descomponerse. El tratamiento térmico suaviza los fosfolípidos en la membrana celular y desnaturaliza las enzimas de ADNsa que, si están presentes, cortarían el ADN en pequeños fragmentos para que no pudiera extraerse.
Figura 1. Coloque el vaso de precipitados de 1000 ml con la cebolla picada y la solución en un baño de agua caliente, a 55-60 ° C, durante 10-12 minutos.
- Enfríe la mezcla en un baño de agua con hielo, a aproximadamente 4 ° C, como se muestra en la Figura 2, a continuación, durante 5 minutos. Durante este tiempo, presione la mezcla de cebolla picada contra el costado del vaso con el dorso de la cuchara. Este paso ralentiza la descomposición del ADN.
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Figura 2. Después de calentar la mezcla, luego enfríe en el baño de agua con hielo a aproximadamente 4 ° C, durante 5 minutos.
- Filtre la mezcla a través de un filtro de café # 6 o cuatro capas de tela de queso colocadas en un embudo o colador sobre un vaso de precipitados nuevo de 1000 ml (o una taza de medir de 4 tazas). Cuando filtre la mezcla de cebolla, trate de evitar que la espuma penetre en el filtrado. A veces se filtra lentamente, por lo que es posible que desee colocar todo el conjunto en el refrigerador y dejar que se filtre durante la noche.
- Dispensar la solución de cebolla en un tubo de ensayo. El tubo de ensayo debe contener aproximadamente 5 ml (1 cucharadita) de solución o estar aproximadamente 1/3 lleno. Para obtener resultados más uniformes entre los tubos de ensayo, agite la solución con frecuencia al dispensarla en los tubos. No es ventajoso dispensar más de 5 ml de solución en un tubo de ensayo. La solución puede almacenarse en el refrigerador durante aproximadamente un día antes de usarse en los siguientes pasos. Cuando la solución se retira del refrigerador, se debe mezclar suavemente antes de llenar los tubos de ensayo.
- Opcional: Agregue dos palillos de dientes llenos de ablandador de carne a la solución de cebolla, tape el tubo y mezcle suavemente para evitar la formación de espuma. El ablandador de carne contiene papaína, una enzima que limpiará las proteínas adicionales del ADN.
- Saque el etanol frío al 95% del congelador y agréguelo al tubo de ensayo para crear una capa de etanol en la parte superior de aproximadamente 1 centímetro (cm). Para mejores resultados, el etanol debe estar lo más frío posible. El etanol se puede agregar a la solución de al menos tres formas: llene una pipeta de riego, una pipeta pasteur o un gotero de medicina con etanol, colóquelo en el fondo del tubo de ensayo y libere el etanol o coloque aproximadamente 1 cm de etanol en el fondo de un tubo de ensayo y agregue la solución de cebolla. O vierta lentamente el etanol por el interior del tubo de ensayo con una pipeta de riego, una pipeta pasteur o un gotero para medicamentos. El ADN no es soluble en etanol. Cuando se agrega etanol a la mezcla, todos los componentes de la mezcla, excepto el ADN, permanecen en solución mientras el ADN precipita en la capa de etanol.
- Deje que la solución repose durante 2-3 minutos sin alterarla. Es importante NO sacudir el tubo de ensayo. Puedes ver el ADN blanco precipitarse en la capa de etanol. Cuando se obtienen buenos resultados, habrá suficiente ADN para enrollarlo en una varilla de vidrio, una pipeta pasteur que se ha calentado en la punta para formar un gancho o un dispositivo similar. Un pincho de madera o una tuerca (varilla metálica pequeña con punta curva) también puede funcionar bien para enrollar el ADN si la pipeta Pasteur no está disponible. El ADN tiene la apariencia de moco blanco.
