Para editar una sola base en el genoma, necesitará tres cosas:
- sgRNA para apuntar a su área de interés
- cas9 para hacer los descansos bicatenarios
- Una molécula de ADN que puede actuar como plantilla durante la reparación dirigida por homología para introducir la mutación puntual
Los puntos 1 y 2 son bastante simples y son los mismos que usarías para eliminar un gen. Para el punto número 3, debe tener brazos de homología que flanqueen su área de interés. La longitud de los brazos de homología es bastante variable y depende de su caso particular. Este pedazo de ADN contendría la base alterada. Tenga en cuenta que la detección, como la mutación, es un desafío. Tener un sitio de restricción en ese punto sería realmente útil o simplemente podría secuenciarlo cada vez que tenga los recursos. Creo que otras técnicas para detectar SNP también podrían ser útiles.
Por simple que parezca, no siempre funciona. Puedo decir por experiencia previa que esto es muy difícil de realizar ya que dependen de muchos factores, incluyendo el área de interés, la longitud de los brazos de homología, etc. En el laboratorio donde solía trabajar antes, estábamos tratando de perfeccionar un solo knock-in base en pez cebra para un gen particular usando CRISPR. Nunca lo hicimos funcionar (pero los esfuerzos aún están en marcha). Si funcionó, nunca pasó a la línea germinal (se transmitió de una generación a la siguiente) o no fue precisa (también tuvo algunas inserciones aleatorias).
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Hay algunos documentos que circulan en Pubmed que hablan sobre la edición precisa de una sola base en ratones y líneas celulares, pero como dije, todo depende de su gen y el organismo que utilice.
