¿Cuáles son algunos buenos consejos de resolución de problemas y optimización de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) que aprendió de la experiencia?

Reactivos

1. El ADN objetivo debe estar lo más limpio posible, a menos que los cebadores sean altamente específicos.
2. Alícuota de todos los reactivos y soluciones de PCR en múltiples tubos eppendorf. La contaminación se puede reducir fácilmente.
3. El agua utilizada para las PCR también debe ser doblemente destilada y alicuotada.
4. Las concentraciones finales de reactivos en solución son: 0.1 – 1 µM cebadores, 1 – 4 mM Mg2 +, 0.8 mM dNTPs (los cuatro en la misma mezcla), y aproximadamente 0.25 unidades enzimáticas Taq polimerasa.
5. Aproximadamente 105-106 moléculas de ADN objetivo son suficientes; esto equivale a 1 µg de ADNg humano, o aproximadamente 1 ng de ADNg bacteriano.
6. Las concentraciones de Mg2 + y dNTP dependen unas de otras, ya que los iones divalentes juegan un papel importante en el complejo cebador-plantilla.

Procedimiento

1. Las pipetas deben etiquetarse para fines específicos y nunca usarse de forma cruzada. Se pueden diferenciar en el uso previo a la PCR y posterior a la PCR para que los que se usan para hacer el medio de carga nunca entren en contacto con el producto amplificado.
2. Agregue un tercer cebador que se una al exterior de los otros dos. El laboratorio de Palumbi en Stanford descubrió que esto mejoraba enormemente la amplificación.
3. Ejecutar en geles al 2% para bandas de longitud entre 300 BP y 2 kBP. Aumente a 3-4% para fragmentos más pequeños.

Cuando no se ve nada: ‘(

• ¿Cómo es asistir a una charla de James Watson?
• ¿Qué es la interacción de apilamiento de bases en la hélice de ADN?
• ¿Cuál es la función de la ligasa en la replicación del ADN?
• ¿Cómo los factores de transcripción controlan la transcripción en eucariotas?
• Cómo comparar y contrastar la expresión génica en procariotas y eucariotas

1. Diluir las concentraciones de ADN objetivo. Mayores concentraciones de ADN pueden conducir a un obstáculo espacial para una replicación mediada por Taq efectiva.
2. Baje las temperaturas de recocido. Tenga en cuenta que esto aumenta las posibilidades de unión inespecífica.
3. Una alternativa al punto 2 es reducir la temperatura de recocido solo durante los primeros 10-20 ciclos, pero aumentar las temperaturas de recocido para los ciclos restantes. Esto permite que los cebadores formen múltiples hebras, y luego selecciona solo las precisas.
4. Otra posible solución es aumentar los ciclos. Comience el alargamiento a una temperatura de recocido más baja y gradualmente aumente la temperatura a 72 grados centígrados. De esta forma, los cebadores pueden recocer fácilmente el ADN, pero los cebadores unidos de forma no específica no se alargarán.

1. Asegúrese de ejecutar un control negativo también.
2. Si está viendo dímeros de imprimación repetidamente, aumentar la temperatura de recocido es una mejor solución.
3. Intente ejecutar más ciclos y cambie la fuente de su ADN objetivo.
4. En casos raros, el ADN puede ser único. Use enzimas específicas para secuencias ricas en GC / AT ricas si es necesario.

   Mancha de bandas

1. Esto probablemente se deba a una falta de coincidencia. Pruebe concentraciones de ADN más pequeñas y mayores temperaturas de recocido.
2. Si se ven múltiples bandas, intente usar solo un cebador a la vez para determinar la especificidad del cebador.
3. Varíe las concentraciones de MgCl2 y observe las diferencias.

5. Si nada funciona, Steve, del Laboratorio Marino Kewalo de la Universidad de Hawai, recomienda que vayas a Hawai y despejes tu mente. Él promete que siempre funciona al regresar (3).

   Procedente de:

1. Protocolos de PCR: una guía de métodos y aplicaciones; Editado por Innis et. Alabama. (Londres, 2002).
2. Life Technologies – Componentes de una mezcla de reacción
3. Stanford University – Palumbi and group’s, The Simple Fool’s Guide to PCR, Version 2.0
4. Microbiología – Solución de problemas de PCR