La temperatura es una variable importante en la técnica de PCR. Una temperatura demasiado baja puede conducir al recocido de cebadores en sitios no específicos, lo que da como resultado productos secundarios de amplicones que no sean de su amplicón de interés. Una temperatura demasiado baja también puede conducir a la dimerización del cebador. Una temperatura demasiado alta puede dar como resultado bajos rendimientos.
Los valores calculados de Tm son, en el mejor de los casos, una aproximación.
Hay dos fases para Touchdown PCR:
- ¿Cuál es el dogma central de la biología molecular? ¿Qué procesos están involucrados?
- ¿Qué es la EIA basada en PCR?
- ¿Qué funciones juegan los dNTP en la PCR?
- ¿Es la entropía de un organismo vivo solo tanto como la entropía de su ADN?
- ¿Cómo regula miRNA la expresión génica si no es por RNAi?
- El ciclo de PCR comienza a 10 ° C por encima del valor de Tm calculado, reduciendo en 1 ° C cada ciclo hasta alcanzar la Tm calculada,
- luego continúa durante 20-25 ciclos más o menos a la Tm calculada.
Las altas temperaturas utilizadas en los ciclos iniciales de la técnica de Touchdown PCR resultan en la acumulación de amplicones con alta especificidad de plantilla de cebador y productos secundarios mínimos. Estos amplicones deseados luego superan a los productos no específicos en la Fase 2.
En la práctica real, las cosas no son tan simples y directas como se indicó anteriormente. Se recomienda que lea las siguientes referencias para comprender las diversas dificultades que pueden ocurrir en Touchdown PCR y sobre la optimización de PCR en general:
1. https://www.nature.com/nprot/jou…
2. Optimización y resolución de problemas en PCR.
3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc…
4.https: //www.biotechniques.com/mu…
El primer artículo (Korbie y Mattick, 2008) está detrás de un muro de pago, pero se puede acceder fácilmente a través de cualquier biblioteca universitaria.
