La respuesta simple a su pregunta es “no hay un límite superior práctico para el tamaño de un plásmido, dependiendo de sus limitaciones”. Los cromosomas artificiales bacterianos pueden exceder fácilmente el tamaño de 100 kilobases, al igual que los vectores de ADN del tipo herpes simple o vacunal, pero más en un minuto.
La maquinaria necesaria requerida para cortar el ADN con tecnología CRISPR de manera múltiple, si está utilizando un método similar a Nissim, et al. [1], es de aproximadamente 10000 bases (suponiendo 4300 pares de bases para Cas9, que corta el ADN, 600 pares de bases para Csy4, que corta una secuencia de ARN específica, 1500 pares de bases para 10 gRNA utilizando la cola híbrida y unidos mediante un corte Csy4 -sitios, un promotor de 1000 pares de bases y algunos miles de bases sobrantes para elementos como aislantes, secuencias de poliadenilación, etc., si desea reducir los efectos de posición y aumentar su eficiencia).
10 kilobases es aproximadamente el límite de tamaño para los vectores lentivirales comunes (que son más o menos el estándar de oro de la terapia génica en este momento), por lo que si todo lo que quería hacer era interrumpir 10 genes, podría tener cierta efectividad allí, pero lo que desea que hacer es reemplazar una secuencia específica de ADN con otra cosa. El método más común para hacerlo es la recombinación homóloga, así que supongamos que tiene 1000 fragmentos de bases que desea insertar en el genoma flanqueado por 500 pares de bases de homología en cada extremo, o 10 2000 casetes de bases (todos en el mismo plásmido). Por supuesto, es posible que solo desee realizar cambios de base específica en algunos casos (por ejemplo, para intentar corregir o inducir mutaciones de base única en genes clínicamente relevantes como la hemoglobina o CFTR), lo que realmente requeriría una región aproximadamente igual a su brazos de homología. Digamos que, en promedio, solo necesita 15000 bases porque desea introducir 5 cosas nuevas y solo modificar una sola base en otros 5 genes.
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En cuanto al tamaño, su gran total de aproximadamente 25000 bases es maní, como mencioné anteriormente, existen varios vectores con una capacidad superior a 100 kilobases. En particular, el uso del vector de vacuna de aproximadamente 180 kb en particular ya tiene precedentes, ya que Amgen acaba de terminar un ensayo clínico de fase III con un virus oncolítico (modificado genéticamente): consulte el artículo Wikipedia Talimogene laherparepvec.
Por lo tanto, la capacidad en sí misma no es el tema central aquí. La dificultad se presenta cuando intenta reemplazar (en lugar de simplemente eliminar) varias cosas a la vez, porque incluso la eficiencia de reemplazo in vitro es bastante baja, si define la eficiencia como “el número de células originalmente en un plato que ocupan el constructo y se modifican de la manera que ellos quieren “. Los números típicos para eso rondan alrededor de 1 * 10 ^ -5 o 1 * 10 ^ -6 en general, y eso es por recombinación de interés homóloga, aunque hay algunas razones para suponer que si obtiene una recombinación para trabajar y tiene la plantilla adecuada, usted tendría una mayor eficiencia para las modificaciones posteriores. Incluso si supone que 1 de cada 10 células que obtienen su plásmido y realizan una recombinación homóloga también realizan correctamente otra recombinación homóloga, todavía tiene una eficiencia de 1 * 10 ^ -14 a 1 * 10 ^ -15. Números como ese son mucho más que inviables para cualquier tipo de enfoque de terapia génica. En otras palabras, su intuición de que debe usar múltiples plásmidos diferentes para múltiples reemplazos es correcta, pero más porque debe hacer múltiples iteraciones de selección y eliminación de resistencia (presumiblemente con recombinasas, pero posiblemente con CRISPR) si está absolutamente casado a la idea de reemplazar varias cosas en el genoma.
Por supuesto, hay alternativas a la introducción de gran cantidad de maquinaria en muchos lugares diferentes; una alternativa obvia y atractiva es introducir mucha maquinaria en un lugar seguro / útil, que es lo que la mayoría de los biólogos que se dedican a generar algo complejo hacer. En ese sentido, el intercambio de casetes mediado por recombinasas, o RMCE, es bastante útil para introducir grandes cargas útiles en ubicaciones definidas (con la advertencia de que debe colocar los sitios de recombinación de antemano, una modificación que posiblemente sea más adecuada para la recombinación homóloga que multiplexada). CRISPR, dado que necesita insertar una sola secuencia en un punto). Un enfoque aún mejor es usar dos recombinasas ortogonales al mismo tiempo, lo que permite una integración de copia única de una secuencia de interés exquisitamente precisa.
Terminaré señalando que desde una perspectiva de eficiencia, definitivamente tiene sentido integrar primero su maquinaria Cas9 (idealmente de manera inducible, por ejemplo, con los llamados sistemas Tet-On, de modo que la adición de doxiciclina activa la expresión de Cas9 y los gRNAs), y luego para agregar cualquier carga útil que necesite integrar en ubicaciones particulares. González y sus colegas han hecho anteriormente exactamente eso para las células madre embrionarias humanas, como se analiza a continuación.
1) Regulación multiplexada y programable de la red de genes … [Mol Cell. 2014].)
2) Una plataforma iCRISPR para Rapid, Multiplexable, … [Cell Stem Cell. 2014]
