Típicamente, un tampón es una solución que puede resistir los cambios de pH neutralizando químicamente pequeñas cantidades de compuestos ácidos o básicos añadidos, manteniendo así el pH general de un medio.
¿Por qué es esto necesario para la PCR?
El ADN es sensible al pH.
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A niveles bajos de pH ( 10), la desprotonación interrumpe los enlaces dinucleotídicos que forman la doble hélice. [1]
La eficacia y la especificidad de la polimerasa en la síntesis catalizadora de ADN es sensible al pH.
El tampón 10X (Taq Polymerase) incluye los siguientes compuestos:
- Tris-HCl 100 mM (pH 8.8 a 25 ° C)
- 500 mM KCl
- MgCl2 15 mM
- 0.8% (v / v) Nonidet P40 *
Tris-HCl
En la PCR, los cuatro desoxinucleótidos individuales que forman una secuencia de ADN generalmente se agregan a la solución en cantidades equimolares. Los reactivos de nucleótidos libres son nucleósidos trifosfatos que contienen iones fosfato en solución que se unen a iones H + libres para formar ácido fosfórico, lo que aumenta la acidez de la solución de PCR.
Para mantener el nivel óptimo de pH de 8.0 – 9.5 para la reacción química de polimerización, Tris-HCl [2] se utiliza como el componente principal de la solución tampón Taq. Es un ácido conjugado débil (o sal) de su base (Tris) que puede mantener un nivel de pH de 8.0 – 9.5 regulando la cantidad de iones H + en la solución.
KCl
El ADN es una molécula cargada negativamente. La columna vertebral de cada cadena está compuesta de azúcar alternante y grupos fosfato cargados negativamente conectados por enlaces de hidrógeno débiles.
KCl facilita la unión del cebador a la plantilla al estabilizar ambos para el recocido. [3] El ion K + en KCl une el grupo fosfato cargado negativamente de cada cadena, reduciendo su carga negativa neta, de modo que el cebador y la plantilla cargados negativamente no se repelen entre sí.
MgCl2
El MgCl2 actúa tanto como cofactor para la polimerasa Taq como un agente estabilizador adicional para el recocido. [4] Durante la fase de alargamiento de la PCR, el desoxinucleósido trifosfato (dNTP) se disocia en el desoxinucleósido monofosfato (dNMP). La polimerasa cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre 3 ‘OH de la cadena de nucleótidos del sustrato y 5’ fosfato del monofosfato de nucleósido precursor.
Reacción de polimerización:
[matemáticas] dNTP + dNMP_ {n} → dNMP _ {(n + 1)} + PP_ {i} [/ matemáticas]
El ion divalente Mg ++ de MgCl2 se une al grupo alfa fosfato de dNTP y facilita la eliminación de sus dNMP formadores de fosfato beta y gamma. Se ha informado que el aumento de la concentración de Mg ++ aumenta la actividad de la polimerasa Taq pero a expensas de la fidelidad. Por otro lado, las concentraciones más bajas de Mg ++ disminuyen la actividad de la polimerasa Taq pero aumenta su fidelidad.
Nonidet P40 (* Opcional)
La polimerización puede dar lugar a la formación de estructuras secundarias en el ADN mediante el plegado o anudamiento de la plantilla o cebadores de ADN, lo que conduce a una disminución del rendimiento del producto o al fracaso de la reacción.
A bajas concentraciones <1%, los detergentes no iónicos, como Nonidet P-40 , funcionan para suprimir la formación de estructuras secundarias, eliminar contaminantes como SDS y ayudar a estabilizar la ADN polimerasa, lo que resulta en una mayor producción de amplicones [5].
Notas al pie
[1] La respuesta de Christopher VanLang a ¿Cuál es la diferencia entre la hidrólisis de ARN y ADN?
[2] Tris – Wikipedia
[3] Papel de KCl y MgCl2 en PCR
[4] Optimización de la reacción en cadena de la polimerasa – Wikipedia
[5] Reacción en cadena de la polimerasa: protocolo básico más estrategias de solución de problemas y optimización
