ZFN, TALEN y CRISPR son métodos para la edición del genoma.
ZFN : esta estrategia de edición genómica utiliza endonucleasas de ADN personalizadas llamadas nucleasas de dedos de zinc (ZFN).
Los dedos de zinc son factores de transcripción; cada módulo de dedo reconoce tres o cuatro bases de secuencia, y al mezclar y combinar esos módulos, los investigadores pueden apuntar más o menos a cualquier secuencia que deseen.
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Como puede ver en este diagrama, las dos estructuras en cada lado son ZFN. Cada ZNF tiene un módulo que puede reconocer alrededor de 3-4 nucleótidos (los bucles grises). Estos módulos son grupos de aminoácidos. Estos módulos confieren la especificidad del gen al investigador. FokI es una endonucleasa de restricción que realiza la acción de causar un corte (o rotura) bicatenario. Esto desencadena un mecanismo de reparación que si se repara por uniones no homólogas propensas a errores (NHEJ) termina causando inserciones y / o deleciones que causan un cambio de marco y eliminan eficazmente el gen.
La eficiencia de tal método es bastante baja, aunque es bastante alta especificidad. Además, la síntesis de la ZFN unida con FokI es bastante costosa y fue difícil sintetizarla en su laboratorio; así que tuvo que ordenar a compañías como Sigma Aldrich.
TALEN : las nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), son factoras / nucleasas de transcripción diméricas construidas a partir de conjuntos de 33 a 35 módulos de aminoácidos, cada uno de los cuales se dirige a un solo nucleótido. Al ensamblar esas matrices, los investigadores pueden apuntar a casi cualquier secuencia que deseen.
Así es como esto luce:
En este caso, cada componente del módulo es específico para un nucleótido. Entonces, dependiendo de su secuencia objetivo, podría construir su TALEN. Nuevamente, como se vio antes, la endonucleasa FokI causará una ruptura bicatenaria que activaría las vías de reparación y terminaría introduciendo un cambio de marco.
Los TALEN tienen muy pocos efectos fuera del objetivo debido a que cada módulo apunta a un nucleótido, pero todavía era bastante bajo en eficiencia.
CRISPR : en el sistema CRISPR / Cas9 (el acrónimo significa: “Repetición palindrómica agrupada, regularmente intercalada, corta (CRISPR) / asociada a CRISPR-9”), la nucleasa Cas9 hace una ruptura bicatenaria en el ADN en un sitio determinado por una guía corta (~ 20 nucleótidos) de ARN. Al igual que con otros sistemas, esa ruptura puede repararse mediante NHEJ o recombinación dirigida por homología, dependiendo de cómo se use.
Sin embargo, a diferencia de ZFN y TALEN, CRISPR / Cas no está hecho por el hombre; El sistema es parte del sistema inmune bacteriano donde ayuda a protegerlo de los fagos invasores.
En CRISPR, la especificidad se proporciona mediante el uso de una molécula de ARN que es complementaria al gen de interés. Una vez unida, esta molécula de ARN (también llamada ARN guía) recluta la nucleasa cas-9 que produce una ruptura bicatenaria, lo que conduce a un cambio de marco si NHEJ la repara.
CRISPR es, con mucho, el proceso más eficiente (para darle una idea, solía trabajar con pez cebra y solía tener días en los que 10/10 embriones mostraban una mutación después de ser inyectados con mi CRISPR). La eficiencia varía según el organismo y la región objetivo.
Para poner todo en una imagen:
