La PCR consiste en una serie de 20 a 40 cambios repetidos de temperatura, llamados ciclos, y cada ciclo consiste comúnmente en dos o tres pasos de temperatura discretos (ver figura a continuación). El ciclo suele ir precedido de un solo paso de temperatura a una temperatura muy alta (> 90 ° C (194 ° F)), y seguido de una retención al final para la extensión del producto final o un breve almacenamiento. Las temperaturas utilizadas y el tiempo que se aplican en cada ciclo dependen de una variedad de parámetros, incluida la enzima utilizada para la síntesis de ADN, la concentración de iones bivalentes y dNTP en la reacción y la temperatura de fusión ( Tm ) de los cebadores. .
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Los pasos individuales comunes a la mayoría de los métodos de PCR son los siguientes:
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- Inicialización : este paso solo se requiere para las ADN polimerasas que requieren activación por calor mediante PCR de arranque en caliente. [14] Consiste en calentar la cámara de reacción a una temperatura de 94–96 ° C (201–205 ° F), o 98 ° C (208 ° F) si se usan polimerasas extremadamente termoestables, que luego se mantienen durante 1–10 minutos.
- Desnaturalización : este paso es el primer evento regular de ciclismo y consiste en calentar la cámara de reacción a 94–98 ° C (201–208 ° F) durante 20–30 segundos. Esto provoca la fusión o desnaturalización del ADN de la plantilla de ADN bicatenario al romper los enlaces de hidrógeno entre bases complementarias, produciendo dos moléculas de ADN monocatenario.
- Recocido : en el siguiente paso, la temperatura de reacción se reduce a 50–65 ° C (122–149 ° F) durante 20–40 segundos, lo que permite el recocido de los cebadores en cada una de las plantillas de ADN monocatenario. Normalmente se incluyen dos cebadores diferentes en la mezcla de reacción: uno para cada uno de los dos complementos monocatenarios que contienen la región objetivo. Los cebadores son secuencias monocatenarias en sí mismas, pero son mucho más cortas que la longitud de la región objetivo, complementando solo secuencias muy cortas en el extremo 3 ‘de cada cadena.
Es crítico determinar una temperatura adecuada para el paso de recocido porque la eficiencia y la especificidad se ven fuertemente afectadas por la temperatura de recocido. Esta temperatura debe ser lo suficientemente baja como para permitir la hibridación del cebador con la cadena, pero lo suficientemente alta como para que la hibridación sea específica, es decir, el cebador debe unirse solo a una parte perfectamente complementaria de la cadena y en ningún otro lugar. Si la temperatura es demasiado baja, la imprimación puede unirse imperfectamente. Si es demasiado alto, la imprimación puede no unirse en absoluto. Una temperatura de recocido típica es de aproximadamente 3–5 ° C por debajo de la Tm de los cebadores utilizados. Los enlaces de hidrógeno estables entre bases complementarias se forman solo cuando la secuencia del cebador coincide muy estrechamente con la secuencia del molde. Durante este paso, la polimerasa se une al híbrido cebador-plantilla y comienza la formación de ADN.
- Extensión / alargamiento : la temperatura en este paso depende de la ADN polimerasa utilizada; la temperatura de actividad óptima para la polimerasa Taq es de aproximadamente 75–80 ° C (167–176 ° F), [15] [16] aunque comúnmente se usa una temperatura de 72 ° C (162 ° F) con esta enzima. En este paso, la ADN polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN complementaria a la cadena de plantilla de ADN mediante la adición de dNTP libres de la mezcla de reacción que son complementarios a la plantilla en la dirección 5 ‘a 3’, condensando el grupo fosfato 5 ‘ de los dNTP con el grupo 3’-hidroxi al final de la cadena de ADN naciente (alargado). El tiempo preciso requerido para el alargamiento depende tanto de la ADN polimerasa utilizada como de la longitud de la región diana de ADN para amplificar. Como regla general, a su temperatura óptima, la mayoría de las ADN polimerasas polimerizan mil bases por minuto. En condiciones óptimas (es decir, si no hay limitaciones debido a la limitación de sustratos o reactivos), en cada etapa de extensión / alargamiento, el número de secuencias diana de ADN se duplica. Con cada ciclo sucesivo, las cadenas de plantillas originales más todas las cadenas recién generadas se convierten en cadenas de plantillas para la próxima ronda de alargamiento, lo que conduce a una amplificación exponencial (geométrica) de la región objetivo específica de ADN.
Los procesos de desnaturalización, recocido y alargamiento constituyen un solo ciclo. Se requieren múltiples ciclos para amplificar el objetivo de ADN a millones de copias. La fórmula utilizada para calcular el número de copias de ADN formadas después de un número dado de ciclos es 2
norte
, donde n es el número de ciclos. Por lo tanto, una reacción establecida para 30 ciclos da como resultado 2
30
o 1073741824, copias de la región diana de ADN bicatenario original.
- Alargamiento final : este único paso es opcional, pero se realiza a una temperatura de 70–74 ° C (158–165 ° F) (el rango de temperatura requerido para la actividad óptima de la mayoría de las polimerasas utilizadas en la PCR) durante 5–15 minutos después de último ciclo de PCR para garantizar que cualquier ADN de cadena sencilla restante esté completamente alargado.
- Retención final : el paso final enfría la cámara de reacción a 4–15 ° C (39–59 ° F) durante un tiempo indefinido, y puede emplearse para el almacenamiento a corto plazo de los productos de PCR.
