Respuesta corta: Suponiendo que su gen no es esencial, y todo funciona perfectamente, tomaría ~ 9-12 meses obtener una línea estable de pez cebra.
Respuesta larga:
- Supongamos que la clonación dura aproximadamente una semana. Una vez que tenga clones, debe transcribir in vitro el ARNm.
- El siguiente paso es inyectar el ARNm en un embrión de una célula. Esto es critico. Cuanto antes realice el corte el embrión, es más probable que el corte se transmita a la línea germinal. Cuanto más fácil se vuelve el resto de este proceso.
- 24 horas después de la inyección, analiza una población de embriones inyectados para detectar InDels. Si los embriones son positivos para una mutación, felicita al resto de los embriones. Tomará 2-3 meses antes de que esos embriones sean sexualmente maduros. Esta es la generación F0.
- Cuando el F0 se vuelve sexualmente maduro, emparejas un F0 con un solo pez de tipo salvaje. En lugar de un análisis por lotes como lo hizo después de la inyección, esta vez permite que los embriones vivan ~ 3-5 días después de la fertilización y luego selecciona individualmente cada uno para detectar InDels. Dependiendo de la eficacia de la inyección, ¡este proceso de detección puede demorar hasta un mes! Si alguna prueba es positiva, eso significa que la mutación se convirtió en línea germinal. Cría el resto de los embriones: esta generación F1 tardará otros 2-3 meses en madurar sexualmente.
- Cada F1 es un nocaut heterocigótico, pero cada F1 es completamente diferente. El estándar es aumentar más de una línea, lo que significa que debe generar la generación F2 estable a partir de más de una F1. Cuando las F1 son sexualmente maduras, se genotipan los adultos y se cruzan por parejas las F1 positivas a tipo salvaje. En 2-3 meses, ahora tiene una generación F2 adulta estable donde cada pez lleva la misma mutación heterocigótica.
- Para hacer un mutante homocigoto completo, debe cruzar F2 positivos entre sí (esto requiere genotipar primero): el 25% de la progenie será su mutante homocigoto completo.
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