La extracción del ADN del bacteriófago M13 es bastante fácil en comparación con la extracción del ADN del fago Lambda. La inyección de una molécula de ADN M13 en una célula de E. coli se produce a través del pilus, la estructura que conecta dos células durante la conjugación sexual. La replicación de M13 no sigue el ciclo lítico y tampoco el ciclo lisogénico, de hecho, la célula bacteriana infectada por el virus M13 produciría y liberaría continuamente el bacteriófago M13 sin lisis. Por lo tanto, en el caso del virus M13, se puede lograr fácilmente un alto título de fago.
Pasos:
- El cultivo de células se centrifuga para eliminar la célula bacteriana. El bacteriófago M13 permanece en el sobrenadante.
- El sobrenadante se transfiere a un tubo nuevo y a la suspensión, se agrega PEG seguido de centrifugación.
- El PEG precipitaría las partículas del fago. El sedimento se redisuelve luego en un tampón.
- Para extraer el ADN, la suspensión se somete a un tratamiento con fenol que elimina las proteínas del fago.
- Después de la centrifugación, la capa de fenol estaría en el fondo del tubo en el que se observa una capa blanca de proteína. El ADN del fago puede aislarse de la capa acuosa superior.
- La capa acuosa se transfiere a un tubo nuevo y se agrega etanol frío.
- El etanol frío disminuye la solubilidad del ADN y, por lo tanto, el ADN se precipita.
- El tubo se seca al aire para eliminar el etanol y el ADN se resuspende en tampón / agua.
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Imagen adoptada de: Brown, TA, 2016. Clonación génica y análisis de ADN: una introducción . John Wiley & Sons.
Referencia y lecturas sugeridas:
- Brown, TA, 2016. Clonación génica y análisis de ADN: una introducción . John Wiley & Sons.
- Yamamoto, KR, Alberts, BM, Benzinger, R., Lawhorne, L. y Trieber, G. (1970) Rápida sedimentación bacteriófaga en presencia de polietilenglicol y su aplicación a la preparación de virus a gran escala. Virology, 40, 734–744. [Preparación de l ADN.]
- Zinder, ND y Boeke, JD (1982) El fago filamentoso (Ff) como vectores para el ADN recombinante. Gene, 19, 1–10. [Métodos para el crecimiento de fagos y preparación de ADN.]
