La detección de secuencias de ADN es fundamental para mucha biología moderna, por lo que se ha desarrollado una gran cantidad de técnicas. Difieren en costo, velocidad, sensibilidad, especificidad, requisitos del instrumento, etc. Una buena manera de entender esto es reconocer que existe una jerarquía aproximada, con herramientas muy básicas que se combinan en métodos que a su vez dan lugar a otros métodos. Estas son algunas de esas tecnologías.
Hibridación de ácidos nucleicos. Tenemos una gran comprensión de cómo los ácidos nucleicos se hibridan y, a menudo, podemos predecir estas interacciones con buena precisión. Entonces, entendemos que los híbridos de ARN-ADN son más fuertes que los híbridos de ADN-ADN, entendemos los efectos de los desajustes y también cómo las concentraciones de cationes monovalentes y divalentes afectan la unión y cómo varios aditivos afectan la unión.
Síntesis de ácido nucleico. Podemos sintetizar secuencias de ADN cortas de forma económica y rápida. No solo podemos usar nucleótidos estándar, sino también una variedad de modificados. Particularmente importantes para la detección son las etiquetas fluorescentes y la biotina. La biotina es útil porque hay una proteína llamada estreptavidina que la une con una afinidad impía. Las imprimaciones también pueden transportar residuos adecuados para la “química de clic” o para la unión a superficies sólidas adecuadas.
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Nucleótidos modificados. Del mismo modo que podemos hacer cebadores, también podemos hacer nucleótidos que tienen una funcionalidad especial, etiquetas de fluorescencia o biotina o con grupos 3 ‘OH bloqueados, y esos bloques pueden eliminarse con productos químicos leves.
ADN polimerasas . Hemos buscado por todas partes y descubierto y caracterizado muchas ADN polimerasas. Entonces, sabemos cuáles son termoestables y cuáles no, lo que empujará a una cadena de ácido nucleico fuera de su camino (“desplazamiento de cadena”) y cuáles no, cuáles están envenenados por qué, lo que durará mucho tiempo un ADN (“altamente procesivo”) y que tienden a caerse después de tiradas cortas, las tasas de error de cada uno y así sucesivamente. También tenemos polimerasas diseñadas para tratar los contaminantes comunes del mundo real del suelo o la sangre que interfieren con las polimerasas comunes.
Otras enzimas Podemos usar enzimas llamadas ligasas para unir dos ADN. Podemos escindir el ADN, agregar o eliminar los fosfatos de su cola, recortar los uracilos en el ADN, eliminar las regiones monocatenarias pero no bicatenarias y muchos otros trucos. Las recombinasas específicas del sitio pueden acoplar dos secuencias de ADN de una manera específica.
Para dar un ejemplo de una técnica que combina esto, considere la PCR. Este método revolucionario permite que se amplifiquen cantidades muy pequeñas de una secuencia de ADN de una mezcla. La PCR estándar utiliza dos cebadores, nucleótidos y una polimerasa termoestable. Al ciclar la mezcla de reacción entre una temperatura que funde el ADN en cadenas individuales y una que permite que los cebadores se unan y se extiendan por la polimerasa, se produce una amplificación exponencial. Esto se puede ejecutar en un gel para detectar diferentes tamaños de productos, como para pruebas forenses de secuencias VNTR.
Pero la PCR estándar no es cuantitativa. Pero si agrega un tercer oligonucleótido a la reacción que se encuentra entre los dos cebadores, márquelo con un fluoróforo más quencher y use una polimerasa termoestable con actividad de exonucleasa 5 ‘-> 3’, entonces cada ronda de PCR liberará ese fluoróforo del apagar y producir señal, una técnica llamada “PCR en tiempo real”.
O puede encapsular la mezcla de reacción en gotas para que la mayoría de las gotas reciban una molécula plantilla cero o una (distribución de Poisson), y luego termociclar el material encapsulado. Esto se llama “emulsión PCR”. Si cuenta el número de gotitas positivas que se pueden usar para volver a calcular la concentración en la muestra original, una técnica conocida como PCR digital.
O puede fijar el extremo 5 ‘de los cebadores a una superficie sólida. Ahora los productos de PCR de una molécula plantilla dada permanecerán en una región limitada de la superficie, formando una “polonia” o grupo de miles de moléculas, todas con la misma secuencia exacta. Entonces, si ahora realiza reacciones cíclicas para leer la secuencia, su señal aumentará en ese factor de miles. Esto subyace al método de secuenciación Illumina; Se utiliza una versión de emulsión PCR aguas arriba de las plataformas 454 e Ion Torrent.
¿Cómo lees esto? Bueno, en Illumina es mediante el suministro de nucleótidos que han bloqueado los grupos 3 ‘OH más un marcador fluorescente. Entonces, la polimerasa solo puede extenderse por una sola base, pero esa base está etiquetada por color. Lea los colores de todos esos grupos. Ahora químicamente retire la etiqueta y el bloque y extiéndalo nuevamente. Imagen de eso y alinear con la primera imagen. Y así sucesivamente, hasta 300 veces (en MiSeq)
En 454 (descontinuado) e Ion Torrent, se utilizan bits clave de la química de la polimerasa. Nuevamente, las polimerasas no son cajas negras sino reactivos bioquímicos bien caracterizados. Cuando se agrega un nucleótido a la cadena en crecimiento, se liberan un ion de hidrógeno (H +) y un pirofosfato. Ion Torrent utiliza un sensor electrónico de pH para detectar la liberación de iones de hidrógeno; 454 usó una cadena de enzimas para convertir la liberación de pirofosfato en un destello de luz.
O suponga que suministra muchos cebadores cortos y aleatorios a una polimerasa de desplazamiento de hebra. Cada vez que se sienta un cebador, la polimerasa lo extenderá, eliminando cualquier hebra previamente extendida con la que se haya topado. Por lo tanto, una muestra completa puede amplificarse mediante dicha amplificación de desplazamiento múltiple, ¡y sin ningún tipo de termociclado!
Alternativamente, suponga que liga el ADN de tal manera (principalmente usando concentraciones muy bajas) para que el ADN forme círculos. Ahora agregue una polimerasa y cebadores altamente procesadores: la polimerasa se sintetizará una y otra vez alrededor del círculo, amplificando el círculo rodando.
O suponga que construye un microscopio para observar las ADN polimerasas individuales, suministrándoles nucleótidos fluorescentes para que la etiqueta se libere cuando se incorpora el nucleótido. Disminuya la velocidad de la polimerasa con mutaciones y báñelo con luz láser excitante, utilizando un ingenioso truco de física para no iluminar nucleótidos a menos que la polimerasa los agarre. Esa serie de señales de color vistas es nuevamente la secuencia del ADN, pero se ejecuta en tiempo real y en decenas de kilobases: el método de secuenciación de Pacific Biosciences.
Existen muchas más técnicas para detectar y secuenciar el ADN. Algunos son radicalmente diferentes: el método de secuenciación de Oxford Nanopore no utiliza ninguno de los trucos anteriores en la secuenciación real, aunque la preparación de la muestra para la secuenciación implica la ligadura.
