La hibridación de ADN generalmente se usa por una de dos razones: desea identificar el tamaño de un fragmento de ADN que contiene una secuencia conocida, pero por alguna razón, la PCR está fuera de discusión O desea hacer una comparación cuantitativa de cuánto ADN de una secuencia conocida está en múltiples conjuntos.
El primer método se llama transferencia Southern, y generalmente se realiza mediante la digestión del ADN genómico con una o un par de enzimas de restricción, resolviendo los fragmentos en un gel de agarosa y luego transfiriendo los fragmentos a una membrana de nylon. Luego, busca una secuencia que le interese utilizando sondas de ADN marcadas con radio o con moléculas pequeñas. (Ambos se hacen mezclando una plantilla de ADN, cebadores aleatorios, nucleótidos marcados y una ADN polimerasa juntos). Después de lavar la sonda no unida de la membrana, puede detectar la sonda unida mediante radiografía (para sondas radiomarcadas) o un anticuerpo. enzima conjugada (para sondas marcadas con moléculas pequeñas). En comparación con la PCR, ¡esto es mucho trabajo!
Las dos aplicaciones más comunes para esta técnica son caracterizar las modificaciones del genoma y determinar la longitud de los telómeros. La primera es difícil de hacer por PCR debido a la alta probabilidad de modificaciones heterocigotas (debe usar cebadores que generen productos para ADN modificado y no modificado; si uno de esos productos se amplifica de manera mucho más eficiente que el otro, nunca será ¡capaz de detectar heterocigotos!) En mi modelo de sistema de elección ( Tetrahymena thermophila ), no tengo más remedio que borrar mis transgenes porque cada célula tiene dos núcleos y solo puedo modificar uno, por lo que múltiples copias no modificadas de cualquier gen al que me dirijo siempre estará presente
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Los telómeros son casi imposibles de amplificar limpiamente por PCR (porque están compuestos de cientos de repeticiones de una secuencia de seis nucleótidos), por lo que la longitud de los telómeros generalmente se determina mediante transferencia Southern.
Algunos protocolos de ChIP (inmunoprecipitación de cromatina) reticulan el ADN de manera tan agresiva que la PCR es difícil. Entonces, en su lugar, puede usar la transferencia de puntos o ranuras para preguntar si tanto y en qué parte de una secuencia que le interesa se ha reducido junto con una proteína. Estas técnicas son básicamente la transferencia del sur sin el gel: simplemente colocas tus conjuntos directamente sobre una membrana y procedes como un Southern desde allí.
También puede usar sondas marcadas con fluorescencia para preguntar dónde se localiza una secuencia de ADN específica dentro de una célula mediante hibridación fluorescente in situ.
