La respuesta de Mike Adams es bastante precisa. La mayoría de las enzimas de restricción cortan una secuencia génica es una forma que deja atrás un saliente de unos pocos nucleótidos en solo una de las cadenas de ADN. Por ejemplo, para la siguiente secuencia:
5′-GTGCGAATTCCC-3 ′
3′-CCCTTAAGCGTG-5 ′
Se aplica la enzima de restricción EcoRI, por lo que su secuencia se vería así:
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5′-GTGCG | | AATTCCC-3 ′
3′-CCCTTAA | | GCGTG-5 ′
Básicamente, tiene un saliente de una secuencia AATT colgando libremente en ambos lados (no tan evidente en el ejemplo anterior debido al espaciado). Por lo tanto, para insertar con éxito la secuencia que desea agregar, necesita que su propia secuencia sobresaliente sea complementaria a las sobras. Como resultado, el uso de la misma enzima produce el mismo voladizo en ambas secuencias, por lo que es más práctico, si corresponde.
Sin embargo, algunas enzimas de restricción, como HaeIII producirán extremos romos, que crean un corte que se ve así:
5′-… AG | | CT … -3 ′
3′-… TC | | GA … -5 ′
En este caso, no necesita usar la misma enzima en su otra secuencia, ya que los extremos romos no ofrecen la opción de complementariedad. En general, el uso de enzimas de restricción de extremo romo puede parecer más fácil al principio, ya que se siente como eliminar la parte del trabajo de “emparejar el voladizo con su complemento”, pero dado que las enzimas de extremo romo no tienen complementariedad, los extremos romos tienden a cerrarse en sí mismos, o las secuencias insertadas se duplican o invierten, lo que reduce en gran medida las posibilidades de éxito de su experimento.
También hay algunas formas de “hacer trampa”, completando o eliminando los nucleótidos sobresalientes de una secuencia usando el fragmento Klenow, convirtiéndolo efectivamente en un extremo romo.
¡Espero que ayude!
