PURIFICA TODO . ¡Seriamente!
Incluso una pequeña cantidad de vector no digerido es suficiente para enmascarar los transformantes exitosos que obtendrá después de una ligadura; Los dímeros de cebadores formados a partir de los cebadores que está utilizando para amplificar su inserto llevarán los mismos extremos y, por lo tanto, se digerirán de la misma manera e interferirán con su ligadura. Cada vez que esté haciendo un tramo de ADN para la ligadura (o el ensamblaje de Gibson o lo que sea), límpielo con una técnica estricta como la purificación en gel seguida de electroelución.
Dibuja mapas de todo antes de siquiera tocar tus pipetas. Saber cuál es la secuencia ideal de lo que está tratando de hacer es muy importante, y no solo lo ayudará a explicar los resultados extraños que seguramente obtendrá, sino que también ayudará a quien herede sus plásmidos una vez que haya terminado .
- ¿Qué cambios se pueden ver en la hélice de ADN, cuando se somete a temperaturas extremadamente bajas?
- ¿Cuál es la diferencia entre duplicación y replicación de ADN?
- ¿Es posible que la tasa de mutación sea mayor en la cadena rezagada en comparación con la cadena principal?
- ¿Qué son los procariotas y eucariotas?
- Estás en un ambiente estéril desde el nacimiento hasta los 18 años, nunca te enfermaste, ¿podrías sobrevivir al mundo si te liberan?
Después de cada manipulación que realice que cambie la secuencia o la longitud de su ADN, ejecute un gel para confirmar que sucedió el resultado deseado. ¡Saber qué hay realmente en sus tubos (y cuánto) ayuda mucho a que la clonación funcione!
Mantenga sus reacciones de PCR frías (4 grados) hasta que esté listo para ejecutarlas; coloque sus tubos en un bloque termociclador precalentado a su temperatura de desnaturalización. Los primeros ciclos de PCR son críticos (ya que esos productos serán los “antepasados” de casi todo en el tubo al final), por lo que la mala preparación de baja temperatura matará sus reacciones.
Diseñe sus cebadores computacionalmente. Me gusta Primer3Plus y lo uso exclusivamente. Todos mis cebadores tienen la misma temperatura de fusión (dentro de un grado más o menos), lo que significa que puedo usar el mismo conjunto de protocolos para todo.
Alícuota tus reactivos en porciones pequeñas (diez o veinte reacciones por tubo son buenas, dependiendo de la cantidad que hagas a la vez) y tira cada una de tus alícuotas actuales cada vez que sospeches de tus reactivos.
Al solucionar problemas, recuerde que su objetivo es hacer que las cosas funcionen, ¡ no entender la razón exacta por la que fallaron! Sea pragmático como el infierno y pruebe un amplio espacio de búsqueda si las cosas no funcionan; una vez que trabajan, solo agradece que lo hayan hecho y sigue adelante.
