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El primer método para crear un perfil de ADN fue RFLP , o polimorfismo de longitud de fragmento de restricción. RFLP no se usa con tanta frecuencia en la actualidad porque requiere una gran muestra de ADN, hasta 25 cabellos o una mancha de líquido corporal del tamaño de una moneda de cinco centavos, y puede tardar hasta un mes en completarse. También requiere examinar múltiples secciones de la cadena de ADN para encontrar variaciones, lo que lleva mucho tiempo y deja más espacio para el error humano. Algunos de los pasos para el análisis RFLP también se utilizan en otros tipos de perfiles de ADN. Para RFLP, los pasos son:
- Separe los glóbulos blancos y rojos con una centrífuga.
- Extraer núcleos de ADN de los glóbulos blancos. Esto se hace bañando las células en agua caliente, luego agregando sal y volviendo a colocar la mezcla en la centrífuga.
- Corte la hebra de ADN en fragmentos usando una enzima de restricción.
- Coloque fragmentos en un extremo de un lecho de gel de agarosa con electrodos. El gel de agarosa está hecho de agar-agar, un tipo de alga marina que se convierte en gelatina cuando se disuelve en agua hirviendo.
- Use una corriente eléctrica para ordenar los segmentos de ADN por longitud. Este proceso se llama electroforesis en gel de agarosa . La electroforesis se refiere al proceso de mover las moléculas cargadas negativamente a través del gel con electricidad. Los segmentos más cortos se alejan más de su ubicación original, mientras que los más largos permanecen más cerca. Los segmentos se alinean en filas paralelas.
- Use una lámina de nitrocelulosa o nylon para secar el ADN. La hoja está manchada para que las diferentes longitudes de las bandas de ADN sean visibles a simple vista. Al tratar la lámina con radiación, se crea una autorradiografía . Esta es una imagen en una película de rayos X que deja el patrón de descomposición de la radiación. La autorradiografía, con sus distintivas bandas paralelas de color oscuro, es el perfil de ADN .
El análisis por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) suele ser el primer paso en la creación de un perfil de ADN en la actualidad. La PCR puede replicar una pequeña cantidad de ADN para crear una muestra más grande para el análisis. Lo hace mediante un proceso repetitivo que dura unos cinco minutos. Primero, se agrega una ADN polimerasa termoestable , una enzima especial que se une al ADN y le permite replicarse. A continuación, la muestra de ADN se calienta a alrededor de 92 ° C para separar los hilos. Luego la muestra se enfría y se vuelve a calentar. El recalentamiento duplica el número de copias. Después de que este proceso se repite unas 30 veces, hay suficiente ADN para un análisis posterior.
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La PCR es el primer paso para analizar los STR (Repeticiones en tándem cortas) , que son alelos muy pequeños y específicos en una repetición en tándem de número variable (VNTR). Los alelos son pares de genes que ocurren alternativamente en un punto específico, o loci, en un cromosoma. Analizar STRs es más preciso que la técnica RFLP porque su pequeño tamaño hace que sea más fácil separarlos y diferenciarlos.
Una variación en el análisis STR es Y-STR. Solo se analizan los STR encontrados en el cromosoma Y (que solo tienen los hombres). El análisis STR es útil si la muestra tiene ADN mixto (de hombres y mujeres) o en casos de agresión sexual con un agresor masculino. Y-STR se procesa como un STR normal.
AFLP , polimorfismo de longitud de fragmento amplificado , es otra técnica que utiliza PCR para replicar el ADN. Al igual que RFLP, primero usa una enzima de restricción. Luego, los fragmentos se amplifican mediante PCR y se clasifican mediante electroforesis en gel. La ventaja de AFLP sobre otras técnicas es que puede automatizarse y no cuesta mucho. Sin embargo, la muestra de ADN debe ser de alta calidad o pueden producirse errores, como es el caso con la mayoría de las técnicas de análisis de ADN. Los analistas pueden pasar un tiempo distinguiendo las hebras más largas porque se agrupan fuertemente.
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