La citometría de masas funciona combinando un par de técnicas diferentes. La premisa básica es en realidad bastante simple. [1] Al igual que en la citometría de flujo, puede usar anticuerpos para etiquetar componentes celulares de interés, pero en lugar de conjugarlos con fluoróforo, los anticuerpos se conjugan con metales. Luego, en lugar de usar láseres para analizar las células, se ejecutan a través de un espectrómetro de masas que cuantifica los metales particulares. Cada metal corresponde a anticuerpos particulares y, por lo tanto, a componentes celulares particulares. La gran ventaja aquí es que, si bien la citometría de flujo lo limita a ~ 10 fluoróforos en la práctica, la espectrometría de masas permite el uso de unas 40-50 etiquetas diferentes, lo que le permite etiquetar un montón de cosas más a la vez.
(esquema del flujo de trabajo de citometría de masas) [2]
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El proceso comienza casi igual que la citometría de flujo. Elige un montón de cosas que desea etiquetar y las tiñe con anticuerpos metálicos conjugados. Los iones metálicos no biológicos estables, típicamente lantánidos, se usan como reporteros. [3] Están altamente purificados, lo que permite la detección de isótopos sin superposiciones, y creo que actualmente hay unos 50 metales disponibles.
Una vez teñidas, las células se analizan usando espectrometría de masas de plasma acoplada inductivamente, o ICP-MS. Este tipo de espectrometría de masas es altamente sensible y precisa (puede detectar concentraciones tan bajas como [matemática] \ frac {1} {10 ^ {15}} [/ matemática] según wikipedia, aunque no estoy seguro de si esa sensibilidad se ha logrado en contextos biológicos). La primera parte de ICP-MS implica nebulizar y ‘secar’ la solución celular líquida antes de calentarla en un plasma e ionizarla. * Este paso es la razón por la cual es importante el uso de metales no biológicos. Como todos los contenidos celulares están ionizados, cualquier metal biológico se incluirá en el análisis y puede sesgar los resultados.
Una vez que ha ionizado el plasma, se utiliza la espectrometría de masas de tiempo de vuelo (la parte ‘TOF’) para analizarlo. TOF identifica los iones (y, por lo tanto, los metales) midiendo literalmente el tiempo que tarda un ion en recorrer cierta distancia y golpear un detector. La velocidad a la que viajan los iones es directamente proporcional a su tamaño (realmente su relación masa-carga) para que pueda identificar qué metal está presente y en qué cantidades. El número de iones se correlaciona directamente con la cantidad de anticuerpo conjugado de metal. Además, los metales que se unen al ADN se pueden agregar a concentraciones conocidas para normalizar la cantidad de células.
Como dije anteriormente, ICP-MS es altamente sensible y preciso. Si bien la citometría de flujo está plagada de problemas a medida que agrega más fluoróforos, como el sangrado entre los reporteros fluorescentes y la auto-fluorescencia, ICP-MS puede medir fácilmente más de 30 reporteros a la vez. Por otro lado, es difícil hacer citometría de flujo con> 3 reporteros sin hacer corrección (tenga en cuenta que esto definitivamente es factible y a menudo se hace). ICP-MS no sufre el mismo problema de superposición espectral y, hasta donde yo sé, no hay ningún tipo de fluorescencia auto-metálica extraña.
Sin embargo, ICP-MS no está exento de inconvenientes. Por un lado, las células se vaporizan literalmente antes de la especificación de masa, por lo que la clasificación de células vivas está fuera de discusión. Además, CyTOF es bastante lento en comparación con la citometría de flujo estándar, por lo que la clasificación a través de poblaciones de células grandes a menudo es inviable. Además, aunque también es la principal ventaja, el hecho de que pueda medir tantos parámetros a la vez hace que el procesamiento de los datos sea inherentemente más difícil. A menudo, en la citometría de flujo, es más sencillo tomar un subconjunto de los datos y simplemente trazar dos o tres dimensiones a la vez, pero este enfoque comienza a tener menos sentido cuando tienes más de cuarenta parámetros. [4] Como tal, se han desarrollado una variedad de técnicas computacionales diferentes para dar sentido a este tipo de datos.
En conclusión, la citometría de masas es una técnica realmente poderosa para perfilar una gran cantidad de parámetros celulares a la vez. Aparentemente, tampoco es mucho más difícil de hacer que la citometría de flujo estándar. Resuelve muchos de los problemas inherentes al uso de reporteros fluorescentes, aunque no sin presentar algunos problemas nuevos. En general, creo que la citometría de flujo y la citometría de masas se consideran complementarias. Cada uno tiene sus propias ventajas e inconvenientes, y la técnica más informativa depende de la situación.
* No estoy 100% seguro de cómo se forma realmente el plasma, por lo que es una descripción potencialmente inexacta. Si alguien considera que esto está mal, hágamelo saber.
Notas al pie
[1] Elsevier: Localizador de artículos
[2] Imágenes altamente multiplexadas de tejidos tumorales con resolución subcelular por citometría de masas: Nature Methods: Nature Research
[3] http://www.sciencedirect.com/sci…
[4] http://www.nature.com/nri/journa…
