Cómo eliminar un gen con CRISPR, por lo que no obtengo expresión de ARNm de mi gen

La eliminación de los promotores puede ser difícil, ya que esas regiones a menudo no están definidas y pueden tener decenas de kilobases de tamaño. Incluso si eliminó la caja TATA como ejemplo, todavía podría haber un sitio de inicio críptico en algún lugar. Los sitios de unión del factor de transcripción para la mayoría de los promotores no están definidos. Podría intentar algo similar a la idea de Brian y Anupam, pero si no tenía los datos, simplemente elimine la región de -1kb a +500 pb del genoma. En general, eso debería cubrir muchas de las señales de inicio esenciales para la transcripción, aunque no elimina todos los potenciadores y otros elementos del promotor.

Si no quieres proteínas, podría diseñar una estrategia para eliminar todos los exones y apuntar a los intrones a su alrededor. El ARNm todavía se realizará, pero no habrá una secuencia de codificación de su proteína en el interior y, por lo tanto, no habrá expresión de confusión de la proteína mutada o truncada.

Usando la reparación dirigida por homología (HDR), podría introducir sitios loxp que flanquean su gen de interés (GOI) creando secuencias lineales de ADN monocatenario con brazos de homología que flanquean los sitios loxp e introduciendo esta plantilla de ADN donante con Cas9 / ribonucleoproteína guía (RNP) ) complejo (Ver Generación de células T humanas primarias knock-in usando ribonucleoproteínas Cas9). Posteriormente, podría expresar Cre en estas celdas para eliminar completamente (y limpiamente) su GOI. Como una modificación a este enfoque, puede reemplazar su GOI con un reportero como GFP para poder visualizar la expresión expulsada del promotor de su GOI.

Sí, con un sitio de corte, puede eliminar el sitio de inicio de la transcripción (cortando y obteniendo una reparación indeleble); con dos, puedes eliminar todo el primer exón o más.

Podría intentar diseñar CRISPR que flanqueen al promotor y lo eliminen del genoma. Eso debería eliminar la transcripción.