Un microscopio de fluorescencia usa ciertas longitudes de onda de luz para excitar colorantes fluorescentes o proteínas para que emitan luz. Los colorantes o proteínas fluorescentes (o fluoróforos, colectivamente) tienen un espectro particular de excitación y emisión. Un fluoróforo absorberá la luz en un cierto rango (el rango de excitación) y emitirá luz en un rango diferente (el rango de emisión). Las longitudes de onda emitidas son siempre más largas que las absorbidas. Por lo tanto, la proteína verde fluorescente (GFP) utilizada comúnmente como una etiqueta de proteína absorbe la luz azul con una excitación máxima de alrededor de 490 nm y emite luz verde con una emisión máxima de alrededor de 510 nm.
Por lo general, en un microscopio fluorescente, una lámpara que emite muchas longitudes de onda diferentes se utiliza como fuente de luz. La luz de la lámpara pasa a través de un filtro especial que solo deja pasar ciertas longitudes de onda apropiadas para el fluoróforo que está utilizando. Esta luz brilla sobre la muestra, y los fluoróforos absorben la luz y emiten su propia luz. La luz emitida pasa a través de otro filtro que solo deja pasar las longitudes de onda de emisión de su fluoróforo, y luego esta luz emitida filtrada es lo que ve a través de los oculares. Los conjuntos de filtros como estos se pueden diseñar para que una sola muestra pueda contener hasta cuatro o más fluoróforos y obtener imágenes bonitas de cada uno individualmente.
También es posible usar un microscopio fluorescente confocal para imágenes fluorescentes, pero tienden a usar láseres para excitar tintes en lugar de una lámpara y filtros, y recolectan y procesan la luz de manera diferente.
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