Como se indicó anteriormente, etiquetar un gen significa que realmente lo está etiquetando, para que sea detectable dentro del cultivo celular, moldeado de animales, etc., que está empleando. Una manera simple de etiquetar un gen, puede ser a través de la PCR. Si piensa en cómo funciona la PCR, se basa en el uso de un cebador directo y un cebador inverso, estos amplificarán su secuencia de interés y harán MÁS de ellos. Por lo tanto, un enfoque útil puede ser diseñar un cebador directo, que no solo pueda recocer la secuencia de 3 ‘a 5’, sino que también lleve un TAG.
Lo siento, no encontré una foto adecuada, así que hice una sola. Como puede ver, las “nuevas copias” de su ADN, también conocidas como amplicones, también tendrán un TAG, esto puede ser, por ejemplo, HA, FLAG o incluso una etiqueta de histidina. Una vez obtenidos, estos se pueden clonar en sus líneas celulares o modelo animal
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Por qué deberías etiquetar un gen, muchas razones:
1- es posible que desee ver si, en esas líneas celulares, su transgen se expresa. Tal vez mutaste un factor de transcripción, de modo que aunque el gen está presente, el ARNm no está hecho. O tal vez usó un enfoque de interferencia de ARN o CRISPR-Cas9 o usó un medicamento para ver si el gen no se expresa. Entonces, lo que puede hacer es, por ejemplo, extraer el ARN, volver a transcribirlo al ADNc y luego usar un cebador que pueda reconocer tanto su gen como el TAG, para que pueda diseñar un cebador cuya secuencia cubra tanto la etiqueta HA por ejemplo como parte de la secuencia del gen. Esto es en realidad, OBJETIVO de un gen etiquetado.
2- creaste un mutante de mutación puntual y quieres ver si al sobreexpresarlo, ves un fenotipo. Entonces, ¿el fenotipo se debe al hecho de que el ARNm no funciona o funciona de manera diferente o porque el gen tiene una mutación que ni siquiera le permite transcribirlo? El TAG en este caso es muy útil para discriminar la forma endógena del gen (fisiológicamente ya presente en su línea celular / genoma modelo animal) del mutado. Esto porque solo la forma mutada también tiene un TAG.
3- usted está usando, por ejemplo, un vector de expresión para expresar y purificar una proteína. Esto se puede hacer usando IMAC (cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados) basada en el enlace covalente coordinado específico de aminoácidos. Entonces, si su proteína expresada tiene una etiqueta de histidina, por ejemplo, puede quedar atrapada en la columna (fijando la carga eléctrica de la columna) y purificada.