Técnicas convencionales de determinación estructural en biofísica
Hasta ahora, los dos métodos principales para la determinación de la estructura macromolecular han sido la microscopía electrónica y la cristalografía de rayos X.
La diferencia más significativa entre estas dos técnicas es que la sección transversal de dispersión es aproximadamente 10 [matemática] ^ 5 [/ matemática] veces mayor para los electrones que para los rayos X. Por lo tanto, cuando se estudian muestras con un grosor del orden de 1 a 10 nm, se prefiere la dispersión utilizando electrones sobre las técnicas convencionales de dispersión de rayos X.
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Otra diferencia importante entre estos dos métodos es que debido a que interactúan y pueden ser desviados por campos eléctricos y magnéticos, los electrones se enfocan más fácilmente que los rayos X. Es por eso que las lentes electrónicas son mucho más superiores que las lentes de rayos X.
Por lo tanto, los electrones se pueden usar para producir una imagen significativamente ampliada de un objeto, y se pueden voltear con la misma facilidad para dar un patrón de difracción.
Esto permite que el microscopio electrónico se cambie de un lado a otro instantáneamente entre los modos de imagen y difracción, de modo que la imagen de una sola molécula con cualquier aumento se pueda obtener tan convenientemente como el patrón de difracción de electrones de un cristal delgado.
Determinación estructural a temperaturas criogénicas
En las primeras etapas de la microscopía electrónica de macromoléculas, se obtuvieron imágenes moleculares después de incrustarlas en una película delgada de manchas de átomos pesados. Sin embargo, más tarde, las macromoléculas fueron investigadas por difracción de electrones e imágenes sin el uso de manchas de átomos pesados al incrustar las muestras en una película delgada de glucosa o en una película delgada de agua rápidamente congelada, lo que requirió que las muestras se enfriaran mientras Fue examinado en el microscopio electrónico.
Este uso de muestras no teñidas condujo a la determinación de la estructura de las moléculas mismas y es lo que condujo al desarrollo de la técnica microscópica crioelectrónica, una forma de microscopía electrónica en 3D de macromoléculas.
Este método permite obtener imágenes de la muestra tal como es, en su forma absolutamente nativa, sin la necesidad de cristalizar. Los biofísicos saben que cristalizar una muestra puede provocar varios cambios innecesarios y evitables en sus propiedades debido a los entornos físicos por los que tiene que pasar.
A temperaturas criogénicas, no es necesaria tal cristalización.
Los cerebros detrás del microscopio crioelectrónico y los premios Nobel de química, 2017
El profesor Jacques Dubochet [1], actualmente en la Universidad de Lausana, publicó una serie de artículos en los años 80 donde mostró la imagen de un adenovirus en una capa de agua vitrificada [2]. También fue uno de los pioneros que demostró que enfriar el ambiente a temperaturas de nitrógeno líquido mientras que la obtención de imágenes podría ayudar a evitar la tinción de la muestra [3].
Pic: Jacques Dubochet, Univ de Lausana
El profesor Richard Henderson [4], del Laboratorio de Biología Molecular de MRC en Cambridge, es uno de los pioneros de la microscopía electrónica de biomoléculas. Uno de sus primeros trabajos, donde estudió e informó la estructura de la proteína de membrana bacteriorrodopsina, publicada en Nature, se considera una de las publicaciones pioneras en imágenes biomoleculares [5].
Foto: Richard Henderson, Cambridge
El profesor Joachim Frank [6], de la Universidad de Columbia, según su página de Wikipedia, es considerado el fundador de cryo-EM de partículas individuales. Comenzó su trabajo en enfoques de partículas individuales en microscopía electrónica en algún momento en 1975, e incluso colaboró brevemente con el profesor Richard Henderson en Cambridge durante uno de sus años sabáticos en Europa. Actualmente, su grupo investiga el mecanismo de traducción en el ribosoma utilizando cryo-EM y la reconstrucción de electrones de partículas individuales.
Pic: Joachim Frank, Frank Lab, Universidad de Columbia
Si esto realmente te interesa, aquí hay algo que puedes leer para obtener más información sobre la física del microscopio crioelectrónico: http://cryoem.ucsd.edu/publicati…
Notas al pie
[1] Prof. Jacques Dubochet – Profesor honorario de biofísica
[2] https://www.researchgate.net/pro…
[3] Microscopía electrónica de agua congelada y soluciones acuosas.
[4] R Henderson en casa
[5] Modelo tridimensional de membrana púrpura obtenida por microscopía electrónica.
[6] Frank Lab
